益气活血软坚解毒方联合奥沙利铂对H-22肝癌细胞的增效减毒作用

★ 张旼旼 黄新宇 戴慧（杭州市肿瘤医院 杭州 310002）

原发性肝癌（简称肝癌）其中90 %为肝细胞肝癌，是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率居第六位，死亡率居第四位［1］。由于肝癌起病隐匿，多数患者初诊时常为中晚期，已失去手术治疗机会。以奥沙利铂（OXA）为主的全身治疗是治疗肝癌的主要手段之一［2］。但OXA在化疗过程中，经常出现神经系统毒性、恶心呕吐、骨髓抑制、肝功能改变、免疫功能下降等不良毒性反应，加上晚期患者体力状况评分低下，常导致患者化疗不能耐受，致使化疗周期延长或者化疗药物减量。益气活血软坚解毒方（YHRJ）是在归纳古代医学文献，结合几十年临床经验主要用于肝癌患者的成熟方剂，研究已证实，YHRJ可以抑制肝癌的生长，提高患者生活质量，延长生存期［3］。本文以肝癌细胞H-22为研究对象，初步探讨YHRJ对OXA的增效减毒作用。

1 材料与方法

1.1 动物、瘤株与药物 BALB/c小鼠：体质量18～22 g，4周龄，雌雄各半，小鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016。饲养条件：恒温，温度（22±2）℃，湿度50 %～60 %，光照每12 h明暗交替，换风次数15～20次/h。瘤株：H-22肝癌细胞,由赛百慷提供，货号：HEPA1-6。药物：益气活血软坚解毒方（YHRJ）组成：生黄芪30 g、炒白术15 g、田三七8 g、水红花子8 g、藤梨根30 g、凌霄花9 g、炮山甲10 g、白花蛇舌草30 g、半枝莲30 g，常规水提取，回流浓缩成浸膏，实验时稀释成等效剂量YHRJ 3.4 g/mL、高剂量YHRJ 6.8 g/mL，4 ℃保存备用。阳性对照药物OXA：江苏恒瑞医药股份有限公司产品，用5 %葡萄糖液调配成1 g/L的溶液，遮光保存。

1.2 动物模型制备与分组 取48只小鼠，收集对数生长期H～22肝癌细胞，调整浓度为1×107个/mL，颈部右侧皮下接种0.2 mL，继续饲养于SPF环境，2-3周后待肿瘤增殖至可以触及时，将动物随机分为6组：A 对照（NS）组；B 奥沙利铂（OXA）组；C等效剂量YHRJ（EYHRJ）组；D等效剂量YHRJ+OXA（EYHRJ+OXA）组；E 高剂量YHRJ（HYHRJ）组；F高剂量YHRJ+OXA（HYHRJ+OXA）组。

1.3 用药 NS组及YHRJ单药组采用灌胃的给药方法，每天分别给于0.9 % NaCl及YHRJ（EYHRJ浓度为3.4 g/mL，HYHRJ浓度为6.8 g/mL）各0.3 mL，1次/d，连续14 d；OXA组采用腹腔注射OXA（剂量为1.5 mg/kg，用5 %葡萄糖液调配成0.5 mL/鼠，1次/d）连续14 d；联合组每天灌胃给予不同剂量的YHRJ 0.3 mL及腹腔注射OXA 0.5 mL，1次/d，连续14 d。

1.4 生化及流式的试剂

表1 主要材料

1.5 实验方法

1.5.1 抑瘤率 每隔3 d观察肿瘤的生长情况，测量肿瘤长径（L）和宽径（W），单位为毫米（mm）。2周后处死小鼠，肿瘤体积=（L×W2）/2；肿瘤抑瘤率=［（A-B）/A］×100 %。（A：对照组肿瘤体积，B：给药组肿瘤体积）。联合作用评价 采用金氏公式评价药物的联合作用。金氏公式：Q = E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。EA、EB分别表示A和B两种药物单独用药的效应；E（A+B）表示药物A和药物B联合用药的效应。如果Q＞0.85为两药具有相加作用，Q＜0.85为拮抗作用。

1.5.2 血常规计数及瑞士-吉姆萨染色 用全自动血液分析仪检测红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）的数值。取小鼠骨髓液，离心后弃去上清，用生理盐水稀释下层沉淀，涂于载玻片上，自然风干，用瑞士-吉姆萨染液染色观察骨髓有核细胞（BMC）。

1.5.3 YHRJ对小鼠肝脏功能的影响 采小鼠心脏血，离心分离血清，采用相应试剂盒测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）。取小鼠肝脏组织，加生理盐水制备成肝组织匀浆，离心后取上清液，用γ-谷氨酰转肽酶试剂盒测定肝脏中γ-谷氨酰肽转肽酶（γ-GT）活性。

1.5.4 YHRJ对小鼠免疫细胞的影响 小鼠取脾脏，裂解后离心获取淋巴细胞液，进行后续实验。

T细胞亚群的检测：取100 μL淋巴细胞悬液，加入1 μL FITC抗小鼠CD3、0.5 μL PE抗小鼠CD4、0.5 μL APC抗小鼠CD8a荧光抗体，进行细胞荧光染色40 min，设置单染及空白对照管；加入细胞洗涤液1.5 mL，振荡混匀，1 500 r/min离心5 min，去上清；加入细胞保存液0.2 mL，振荡流式检测。

B细胞的检测：取100 μL淋巴细胞悬液，加入单克隆抗体1 μL FITC抗小鼠CD3，1 μL APC抗小鼠CD19进行细胞荧光染色40 min，设置单染以及空白对照管；加入细胞洗涤液1.5 mL，振荡混匀，1 500 r/min离心5 min，去上清；加入细胞保存液0.2 mL，振荡悬浮细胞，流式检测。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差（）表示。两组间比较采用两个独立样本的t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑瘤率

图1 YHRJ对小鼠肝癌的抑制作用

表2 各组小鼠肿瘤终体积及抑瘤率（ ，n=8）

图1、表2可见，给药2周后，除EYHRJ组外，其它组各肿瘤大小较NS组均明显减小（P＜0.05或P＜0.01）；两联合组的抑瘤率均达到35 %以上，两联合组肿瘤大小均小于OXA单药组，其中，HYHRJ+OXA组较OXA单药组有统计学差异（P＜0.01）。根据金正均公式计算结果，EYHRJ、HYHRJ与OXA联合均具有相加作用，表明YHRJ能够增强OXA的抑瘤作用。

2.2 YHRJ对小鼠血常规、骨髓有核细胞的影响 较NS组，OXA单药组中RBC、WBC、HGB、PLT和BMC的数目均减少，其它各给药组中上述细胞数目均增多。其中，EYHRJ组中，除WBC外，其余细胞的数目较NS组增多具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。该结果提示在肿瘤的治疗过程中，YHRJ可以保护RBC、HGB、PLT及BMC。较OXA单药组，两联合组中RBC、BMC细胞数目均明显升高，表明YHRJ尤其可以保护RBC、BMC，具有抵抗OXA化疗引起的骨髓抑制作用（表3和图2）。

图2 小鼠骨髓有核细胞吉姆萨染色图（400倍）

表3 各组小鼠血常规细胞、骨髓有核细胞数目变化（ ，n=8）

2.3 YHRJ对小鼠肝功能的影响 表4中可见，与NS组比较，OXA组中除ALT值外，AST、ALP、γ-GT值均显著上升（P＜0.01），EYHRJ组、HYHRJ组中除ALT外，AST、ALP、γ-GT值均显著下降（P＜0.01），表明YHRJ可以降低肝功能指标，对肝功能具有保护作用;与OXA组比较，两联合组中除ALT值外，AST、ALP、γ-GT值也均显著下降，提示YHRJ可减轻OXA引起的肝功能损害（P＜0.01）。

表4 YHRJ对小肝脏功能的影响（ ，n=8）

2.4 YHRJ对小鼠免疫细胞的影响 与NS组比，OXA单药组给药后CD3+T细胞（右下象限）、CD3+CD4+T细胞（右上象限）、CD3+CD8+T细胞（右上象限）、CD3-CD19+B细胞（左上象限）均显著下降（P＜0.05，P＜0.01）；EYHRJ组、HYHRJ组上述各淋巴细胞均显著上升（P＜0.05，P＜0.01）；与OXA相比，EYHRJ+OXA组中除CD3+CD4+T细胞外，其余各淋巴细胞均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），HYHRJ+OXA组各淋巴细胞群较OXA组则无显著差异（表5和图3-4）。该结果表明，YHRJ具有保护免疫细胞的功效，EYHRJ可以显著改善OXA化疗引起的免疫功能低下。

表5 YHRJ对小鼠淋巴细胞群的影响（ ，n=8） %

图3 YHRJ对小鼠T淋巴细胞群的影响

图4 YHRJ对小鼠B淋巴细胞的影响

3 讨论

中医学在治疗恶性肿瘤方面有着固本培元的优势，YHRJ是临床常用的治疗肝癌的中药复方制剂，主要成份有生黄芪、炒白术、藤梨根、白花蛇舌草、半枝莲、水红花子、田三七、凌霄花、炮山甲等，其中，生黄芪、炒白术可扶正固本，藤梨根、白花蛇舌草能够清热解毒［4］，半枝莲、水红花子具有抗菌、激活增强机体免疫的功能［5-7］，田三七、凌霄花主治活血化淤［8］，炮山甲具有去瘀散结的功效［9］。扶正固本、清热解毒、活血化瘀、软坚散结是中医药治疗癌症的主要法则，且中药复方制剂具有整体协同的作用，可通过抑制肿瘤细胞增殖，抑制血管生成、刺激免疫细胞、改善免疫功能等多个途径控制肿瘤进展。

本研究结果中，YHRJ对H-22肝癌细胞移植瘤具有一定抑制作用，当与OXA联合时，可增强其抑瘤作用，联合用药具有相加作用，抑瘤率可提高到35 %以上。YHRJ可回升造血细胞，尤其是红细胞和骨髓有核细胞，改善肝功能，对OXA化疗中引起的骨髓抑制、肝功能改变具有显著的保护作用。YHRJ还可以调节免疫细胞，提高免疫功能。晚期肝癌的患者由于体力状况不佳，免疫功能低下，往往不能耐受两药或者三药方案的联合化疗。YHRJ具有抑制肿瘤增殖、保护骨髓造血细胞、改善肝功能、调节免疫功能的作用，与化疗药联合，发挥其增效减毒的作用，为晚期肝癌的治疗带来新的思路和方法。在临床使用时，可按照药物在动物与人体间剂量换算原则来计算出适应人体的合适联合用药剂量［10］，但由于YHRJ为复方制剂，具体应用时，仍需考虑到患者的个体差异及需要实施医师拥有更多的临床经验。