苍附导痰丸上调TNF-α并激活P65和JNK改善多囊卵巢综合征的研究

★ 骆世存 黄长盛 凌静 彭小鹏 张玲玲 吴惠君（.深圳市中医院妇产科 广东 深圳58033；.华中科技大学协和深圳医院/深圳市南山区人民医院 广东 深圳 5805）

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见的复杂异质性内分泌疾病，育龄妇女发病率大约为5 %～10 %［1］。根据2003年修订的PCOS诊断标准专家共识，同时存在稀发排卵或无排卵，雄激素过多症和多囊卵巢形态三个特征中的两个，同时排除其它病因即可诊断为PCOS［2］。PCOS可出现月经功能障碍、肥胖、痤疮、多毛症和代谢综合征，但其潜在机制尚未明确［3-4］。目前已证实口服避孕药（OCP）、克罗米芬柠檬酸盐（CC）和二甲双胍等药物可治疗月经不调、诱导排卵并调节高雄激素血症［5］。但OCP对部分患PCOS的女性有禁忌症，CC虽可有效诱导排卵但怀孕率非常低，而二甲双胍也会引起胃肠道疾病等不良反应，因此寻找治疗PCOS的替代药物迫在眉睫［6］。目前中药逐渐在PCOS治疗中发挥重要作用，研究表明吴丽丽等自拟温经消瘕汤可降低PCOS患者的胰岛素抵抗程度［7］；陈氏育卵汤能改善PCOS患者高雄激素状态，促进卵泡发育［8］；补肾化痰活血方联合针灸能明显改善PCOS不孕患者子宫内膜容受性，提高妊娠率［9］。苍附导痰丸（CFDT）是一种中国传统的中药配方，已证明可有效缓解PCOS患者症状，如增加排卵率、减轻肥胖、调节内分泌紊乱等，从而改善PCOS患者的妊娠结局［10］。但目前对其分子调节机制的研究仍然十分有限。PCOS患者长期处于一种慢性炎症状态，患者体内肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子水平升高，同时炎症相关信号通路核因子κB（NFκ-B）转录因子p65和N-末端激酶（JNK）蛋白激酶被激活［11-13］。在本研究中，我们旨在探讨TNF-α水平升高，NFκB通路中p65和JNK的失调是否参与PCOS致病机制，并评价CFDT在大鼠PCOS模型中的疗效。

1 材料与方法

1.1 动物分组 研究纳入40只6周龄SPF雌性SD大鼠（购自中国中山大学实验动物中心），在喂食一周后随机分成4组（每组10只），分别为：正常对照组，PCOS模型组（PCOS），PCOS+CFDT实验组（PCOS+CFDT），PCOS+克罗米芬柠檬酸盐阳性对照组（PCOS+CC）。

1.2 PCOS大鼠模型的构建和干预 将纳入的6周龄SPF雌性SD大鼠皮下注射脱氢表雄酮（30 mg/kg/d）和0.2 mL注射用油剂，随后持续4周对大鼠皮下注射胰岛素（2 IU/d）（诺和灵，美国）构建PCOS模型。PCOS模型组：造模后第1～14 d给予生理盐水；PCOS+CFDT实验组，造模后第1～14 d灌胃苍附导痰丸水提浓缩液24g/kg/d；PCOS+CC阳性对照组：造模后第1～14 d灌胃克罗米芬悬液20 mg/kg/d。苍附导痰丸（CFDT）加减配方（中国中药深圳市中医院制剂中心中药实验室）：苍术10 g、香附10 g、制半夏10 g、橘红10 g、白茯苓15 g、炙甘草10 g、菟丝子15 g、柴胡10 g、白芍10 g、生地20 g、川芎10 g、黄芪20 g、黄芩10 g等十三味中药组成，水提2次，浓缩，含生药2.5 g/mL，4 ℃保存。

1.3 指标观察

1.3.1 体重和性激素水平测量 药物处理后第14 d记录大鼠体重，然后腹膜内注射0.3 mL 2%戊巴比妥麻醉大鼠，收集血液。以3 000 rpm的速度离心20 min后，通过酶联免疫吸附测定试剂盒（Adlitteram Diagnostic Laboratories，CA，USA） 测量睾酮（T）和雌二醇（E2）的血清水平，按说明书进行操作。

1.3.2 卵巢形态 解剖卵巢组织并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤，制备石蜡包埋切片，用10%多聚甲醛固定5 h后，将切片脱水并包埋在石蜡中并用苏木精和伊红染色，脱水、透明、封片后用显微镜下评估卵巢形态。

1.3.3 免疫组化（IHC） 用10%多聚甲醛固定包埋切片并用1%Triton X-100透明化。用PBS洗涤两次后，在4℃下分别与TNF-α抗体（SC-52746，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），TNF R1抗 体（SC-8436，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），TNF R2抗体（SC-8041，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），p-p65抗 体（SC-136548，Santa Cruz，CA，USA，1∶100），p65 抗体（CST-8242，Santa Cruz，CA，USA ，1∶50） ，JNK 抗 体（SC-7345，Cell Signal Technology，MS，USA，1∶200） 和 p-JNK 抗 体（SC-135642，Santa Cruz，CA，USA，1∶100） 孵育过夜。洗涤两次后，将切片与二抗一起孵育1 h后，用3,3-二氨基联苯胺（DAB）染色并在显微镜下测定这些蛋白质的相对表达量。

2 结果

2.1 CFDT改善大鼠模型的PCOS综合征 给药前，各组PCOS大鼠体重无显著差异，且均高于正常对照组（对照组），提示PCOS造模成功。给药后，与PCOS模型组相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC中大鼠体重显著降低（图1A）。HE染色结果显示，正常组卵巢组织结构清晰，形态完整，卵泡中有多个颗粒细胞，有卵母细胞和辐射冠。相反，PCOS组的卵巢组织紊乱，白膜表面增厚，组织中有不同阶段的卵泡，包括闭锁卵泡和囊性扩张的卵泡。卵泡中颗粒细胞的数量显著减少，卵泡和辐射冠中没有卵母细胞。 PCOS + CFDT和PCOS + CC组大鼠卵巢组织的结构和形态无明显异常（图1B）。与正常组相比，PCOS模型组血清睾酮（T）和雌二醇（E2）水平显著上调，而PCOS + CFDT和PCOS + CC组的血清T和E2水平低于PCOS组（图1C-D）。

图1 CFDT对体重，卵巢形态和性激素的影响。

2.2 CFDT可逆转PCOS大鼠TNF-α，TNF R1和TNF R2的表达 IHC结果提示，与正常大鼠卵巢组织相比，PCOS模型组的卵巢组织中TNF-α，TNF R1和TNF R2的表达水平显著上调。与PCOS组相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC组卵巢组织中TNF-α，TNF R1和TNF R2的表达水平显著下调，且与正常大鼠的水平无显著差异，见图2。

图2 各组TNF-α，TNFR1和TNFR2表达水平

2.3 CFDT抑制PCOS大鼠p65和JNK的活化 与正常组的卵巢组织相比，PCOS模型组卵巢组织中p-p65和p65的表达显著上调。而PCOS + CFDT和PCOS + CC组大鼠卵巢组织中p-p65和P65的表达水平显著低于PCOS模型组，并与正常组蛋白表达水平无显著差异，见图3。此外，与正常组相比，PCOS模型组卵巢组织中p-JNK的表达上调。与PCOS模型组大鼠相比，PCOS+CFDT和PCOS+CC组大鼠卵巢组织中p-JNK的表达水平显著下调，与正常组相比无统计学差异。各组间JNK总蛋白表达水平无明显变化。

图3 各组p65，p-p65，JNK和p-JNK表达水平

3 讨论

本研究证实了CFDT可改善卵巢形态，并发挥了类似CC的疗效，可下调性激素水平，在CFDT和CC处理的PCOS大鼠中高表达的TNF-α及两个下游受体TNFR1和TNFR2表达水平显著降低。PCOS模型大鼠中p65和p-p65高表达，而CFDT和CC处理可抑制其表达。同时PCOS大鼠中p-JNK明显升高，而各组间JNK无明显变化，提示PCOS大鼠模型中，p65和JNK的激活与CFDT丸的作用有关。

CC用于PCOS患者在无排卵PCOS中诱导排卵，经济成本低，不良反应风险也较低。然而，大约15 %～40 %PCOS患者对CC没有治疗反应，CC对妊娠结局的影响仍然不能令人满意［14］。中药可为PCOS女性提供替代疗法。有研究表明CFDT对PCOS治疗有益，这也在本研究中被证实［10］。本研究发现，CFDT可减轻体重，减少颗粒细胞减少和卵巢功能紊乱，并逆转PCOS大鼠失调的T和E2激素，避免机体出现胰岛素抵抗和其它PCOS样表现［15-16］。除此之外，通过使用CC作为阳性对照，进一步验证CFDT在改善体重、卵巢形态和性激素方面具有与CC相同的效果。这些发现表明CFDT可能减轻了PCOS大鼠肥胖及排卵功能障碍，并可作为对CC没有反应的PCOS女性的替代疗法。

PCOS的确切病因尚不清楚，遗传和环境特征被认为是相关的影响因素［17］。一项研究表明，PCOS表现为低度促炎状态，外周循环测定显示一组细胞因子，包括TNF-α、一种已知的胰岛素抵抗的促炎介质均在PCOS女性中升高［18］。此外，先前的研究表明TNF-α诱导的炎症状态将直接上调卵巢卵泡膜细胞类固醇生成酶，促进多囊卵巢中雄激素的产生［19］。

P65是核因子 κB（NF-κB）的亚基，可被TNF-α磷酸化。在某些情况下，p65的激活与JNK的磷酸化有关［20］。据报道，正常和超重PCOS患者的NF-κB通路中p65表达均高于没有PCOS的患者［21］。p65可能促进TNF-α从循环的单核细胞中释放，并导致进一步引发炎症和胰岛素抵抗。本研究观察到CFDT可降低PCOS大鼠体重、下调TNF-α水平和升高TNF-α受体的表达。此外，还观察到p65，p-p65和JNK的上调表达可被CFDT部分逆转。本研究中应用CFDT治疗可恢复可能由TNF-α诱导的p65和JNK的激活导致体重和性激素的上调，该结果提示TNF-α的上调和p65和JNK的激活与PCOS等有效治疗有关，

综上所述，CFDT可发挥与CC一致的对PCOS大鼠的保护作用，其机制可能与NF-κB p65和JNK的激活有关。