白茶加工过程中糖苷类香气成分的代谢变化

项丽慧，王丽丽，陈 林*，宋振硕，张应根，余文权，陈 键

(1.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院，福建 福州 350002)

茶叶香气是反映茶叶品质的重要因子之一。在茶鲜叶中许多香气成分以糖苷形式(GBVs，Glycosidically-bound volatile compounds)存在，如顺-3-己烯醇、苯乙醇、苯甲醇、香叶醇、芳樟醇及其氧化物等[1]。糖苷水解在红茶和乌龙茶香气形成中的作用已基本明晰。红茶中的苯甲醇、苯乙醇和香叶醇，主要来源于揉捻过程樱草糖苷(苯甲醇、苯乙醇和香叶醇)水解释放[2,3]。乌龙茶加工过程中，由于细胞保持较完整的形态[4]，樱草糖苷和樱草糖苷水解酶处于区室分离状态，无法发生水解反应。在乌龙茶做青过程游离态香气成分并非来源于糖苷水解[3,5,6]。芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇等是白茶的主要挥发性物质[7,8]。在白茶加工过程中，这些糖苷类香气成分源自糖苷水解或从其他物质转化而来尚待探究。糖苷物质在白茶萎凋过程中呈现水解与合成动态变化。苯乙基和苯甲基葡萄糖苷含量在萎凋全程基本保持稳定，其余葡萄糖苷下降；顺-3-己烯醇、苯乙醇、芳樟醇、香叶醇的樱草糖苷在萎凋后期出现了明显升高[9]。为解析白茶加工过程中糖苷对香气形成的作用，本文分析了白茶加工对β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因表达量、β-葡萄糖苷酶活性、香气成分的影响。根据糖苷类香气成分相关代谢通路分析，探讨白茶糖苷结合态香气的形成途径，以期为基于萎凋失水的茶叶增香工艺技术调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验茶样为福鼎大毫茶(Camelliasinensisvar.sinensisFuding Dahaocha)一芽二、三叶，采摘自福建省农业科学院茶叶研究所(福安市社口镇)试验茶园。顺-3-己烯醇、苯甲醇、苯乙醇、香叶醇、苯甲醛、水杨酸甲酯、芳樟醇购自国内化学试剂公司代理的进口原装或分装试剂。CAR/PDMS固相微萃取头(75μm；美国Supelco公司)。7890A/5975C气质联用仪(美国Agilent 公司)。MP Fastprep-24 5G组织研磨仪(美国MP Biomedicals公司)。β-葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 样品制备

采用微波固样方式制得茶鲜叶样品[10]。将其余茶鲜叶薄摊于尼龙网筛上，置于室内进行控温除湿(温度20±1℃，相对湿度60±5%)萎凋，并将萎凋减重了64%的萎凋叶放入烘箱，80℃烘至足干，获得白茶样品。上述茶鲜叶和白茶样品用于香气成分检测。另外在茶鲜叶萎凋减重0(S0)、10%(S1)、20%(S2)、30%(S3)、40%(S4)、50%(S5)、60%(S6)、64%(S7；白茶萎凋结束)阶段进行液氮固样，样品用于基因表达和酶活性检测。

1.3 香气成分检测

参照王丽丽等[8]建立的香气成分检测方法，具体操作如下：称取磨碎试样5.0 g(过40目筛)于250 mL锥形瓶，加入150 mL沸超纯水，拧紧带本色PTFE/硅胶隔垫的自制活塞，置60℃恒温水浴。磁力搅拌茶水混合液10 min后，将老化后的CAR/PDMS固相微萃取头(75 μm；美国Supelco公司)迅速插入样品瓶上方。加热吸附30 min后，取出萃取头，并迅速插入7890A/5975C气质联用仪(美国Agilent 公司)进样口，热解吸5 min，用于GC-MS分析(萃取头插入进样口，同时启动仪器采集数据)。

色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)；进样口温度：250℃；程序升温：50 ℃，保持1 min；以2 ℃·min-1速率升至80℃，保持1 min；再以5 ℃·min-1速率升至160℃，保持1 min；最后以10℃·min-1速率升至220℃，保持10 min，升温程序结束。载气：氦气(纯度>99.999%)；柱流量为1.0 mL·min-1；进样方式：不分流进样。质谱条件：EI离子源；离子化电压70 eV；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；辅助通道温度：250℃；电子倍增器电压：350V；扫描时间：0.5～50.0 min；质量分析范围(m/z)：40～600。通过NIST2011谱库检索和标准品鉴定香气成分。

1.4 糖苷水解酶基因表达量分析

采用植物总RNA提取试剂盒(中国北京天根生物科技有限公司)提取样本总RNA，各取2 μg的RNA用于建库测序，采用Illumina Hiseq 4000(美国加利福尼亚州圣地亚哥Illumina，Inc.)测序。以舒茶早茶树基因组[11]作为参考基因组，使用tophat 2(v2.1.0)[12]进行数据比对。利用HTSeq(v 0.5.4 p3)软件计算FPKM，用于衡量基因表达水平[13]。β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶基因序列信息来源于参考文献[14,15]。

qRT-PCR分析：以RNA为模板，按 TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 的说明书进行反转录。引物序列见表1。qRT-PCR采用TransStart®Top Green qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行。使用美国ABI QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪检测β-樱草糖苷酶在样本中的相对表达量。3个葡萄糖苷酶基因(CsGH1BG6、CsGH1BG67和CsGH1BG626)相对表达量数据引用文献[14]。

表1 内参基因和目标基因qRT-PCR分析的引物序列

1.5 β-葡萄糖苷酶活性检测

β-葡萄糖苷酶活性检测方法为对硝基苯酚显色法[16]。将5 g样品在冷冻状态下捣碎，用镊子取出约0.2 g叶片放入2 mL离心管，离心管内预先加入A裂解介质(石榴石、陶瓷球)及0.2 g PVPP，然后加入1 mL提取液，使用MP Fastprep-24 5G组织研磨仪(美国MP Biomedicals公司)进行研磨，其余步骤参照β-葡萄糖苷酶活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，微量法)方法操作。酶活力单位(Unit)定义为测定条件下，每分钟水解1 nmol对硝基苯酚β-葡萄糖苷的酶量。

1.6 数据分析

使用STEM软件进行趋势分析；使用Excel软件进行单因素方差分析和相关性分析；采用GraphPad Prism 7.04绘制柱形图和折线图。

2 结果与分析

2.1 白茶工艺对糖苷来源香气成分的影响

鉴定了8个糖苷来源香气成分，结果显示，茶鲜叶经过萎凋和干燥工序后，显著增加的包括水杨酸甲酯、香叶醇、苯甲醛、苯乙醇、芳樟醇；顺-3-己烯醇和苯甲醇无显著差异；呋喃型芳樟醇氧化物显著减少(图1)。

图1 白茶加工工序对糖苷来源香气成分的影响Fig.1 Changes on glycosidically-bound volatile compounds in white tea during processing注：1-8分别为水杨酸甲酯、香叶醇、呋喃型芳樟醇氧化物、顺-3-己烯醇、苯甲醛、苯甲醇、芳樟醇和苯乙醇；*表示差异达显著性水平(p<0.05)，**表示差异达极显著性水平(p<0.01)。图2、图5同。

2.2 在萎凋过程糖苷水解酶基因表达量的变化

根据水解底物不同，可将糖苷水解酶分为β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。为了探究糖苷代谢对茶叶香气的贡献，测定了茶鲜叶萎凋过程β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因的表达量，并进行荧光定量PCR验证。结果表明，与S0相比，S2阶段β-樱草糖苷酶基因表达量极显著降低，S2至S7阶段表达量变化小(图2)。采用STME软件对28条β-葡萄糖苷酶基因表达量进行趋势分析(图3)，获得1种显著富集模型(Profile#1)，Profile#1包括11条酶基因，表达趋势为持续下调。值得关注的是，Profile#7(CsGH1BG21和CsGH1BG6)表达持续上调，Profile#5(CsGH1BG15)在萎凋阶段S0-S5阶段持续上调，随后急剧下降。qRT-PCR分析显示(图4)，β-樱草糖苷酶基因表达下调，2个β-葡萄糖苷酶基因(CsGH1BG6和CsGH1BG26)先升后降，在S4之前CsGH1BG7相对表达量微降，在S7阶段上升。qRT-PCR分析结果同转录组表达趋势基本一致。

图2 茶鲜叶萎凋过程β-樱草糖苷酶基因表达量变化Fig.2 Expressions of β-primeverosidase gene in white tea during withering

图3 茶鲜叶萎凋过程β-葡萄糖苷酶基因表达变化趋势Fig.3 Expressions of β-glucosidase genes in white tea during withering注：每个方框表示一种趋势模型。在方框左上方数字为模型编号，左下方为基因数量。红色方框表示该模型有显著性富集(P<0.05)。

图4 茶鲜叶萎凋过程β-樱草糖苷酶(BP)和β-葡萄糖苷酶(BG)相对表达量变化Fig.4 Relative expressions of β-primeverosidase (BP) and β-glucosidases (BG) genes in white tea during withering

2.3 萎凋过程β-葡萄糖苷酶活性及其基因表达的相关性

为了解β-葡萄糖苷酶基因水平和蛋白水平的调控情况，分析了茶鲜叶萎凋过程β-葡萄糖苷酶活性变化及其编码基因表达量的相关性。结果显示β-葡萄糖苷酶活性在萎凋减重≤30%阶段逐渐升高，萎凋减重30%(S3)与鲜叶(S0)存在显著差异，之后活性趋于稳定(图5)。11个基因表达量与β-葡萄糖苷酶活性呈负相关，8个基因表达量与β-葡萄糖苷酶活性呈正相关(图6)。CsGH1BG6、CsGH1BG21与β-葡萄糖苷酶活性呈正相关，相关系数大于0.6。

图5 茶鲜叶萎凋过程β-葡萄糖苷酶活性变化Fig.5 Changes on β-glucosidase activity in white tea during withering

图6 β-葡萄糖苷酶活性与GH1基因表达的相关性Fig.6 Correlation between β-glucosidase activity and GH1 gene expression of white tea注：ns表示相关系数无统计学意义，未标注为相关系数有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论与结论

在白茶加工过程，5个主要的糖苷类香气成分显著增加，与前人研究一致[7, 9,21]。白茶加工包含萎凋和干燥两个工序。白茶萎凋失水重，时间较长，是白茶品质形成的主要工序。本试验主要探讨萎凋对糖苷类香气成分及代谢酶的变化，以期探明糖苷类香气成分的代谢变化。

这些糖苷类香气成分以樱草糖苷和葡萄糖苷两种形成存在于茶树体内，分别被β-樱草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶水解释放。通常在细胞破碎的情况下，樱草糖苷发生酶促水解，含量大幅减少[2,4]。然而在长时萎凋过程，叶细胞分区仍处于较为完整状态，樱草糖苷发生水解可能性低。本研究结果显示萎凋过程β-樱草糖苷酶表达量减少，樱草糖苷并未出现大幅减少[9]，推测白茶中的香叶醇、苯乙醇、芳樟醇、苯甲醛、水杨酸甲酯的大量积累并非来源于樱草糖苷酶解途径。然而，β-葡萄糖苷酶在萎凋前期显著增加。在茶鲜叶萎凋过程中CsGH1BG6、CsGH1BG15和CsGH1BG21基因表达上调，CsGH1BG6、CsGH1BG 21与β-葡萄糖苷酶活性呈正相关。Zhou Y认为CsGH1BG1可水解葡萄糖苷释放苯甲醇和芳樟醇[17]。芳樟基、香叶基的葡萄糖苷在萎凋过程中呈减少趋势[9]。相比樱草糖苷，茶叶中芳樟基、香叶基的葡萄糖苷含量较低[3]。由此推测CsGH1BG6和CsGH1BG21编码的葡萄糖苷酶水解了葡萄糖苷，释放了部分的香叶醇和芳樟醇。

除了糖苷水解途径，这些香气成分的积累还有可能是源于非酶促水解反应及从头合成途径。我们发现白茶加工过程积累了大量的苯乙醇，这与前人研究结果一致[7,9]。然而苯乙基葡萄糖苷在萎凋过程中基本保持稳定[9]，因此可排除葡萄糖苷水解途径。苯乙基樱草糖苷在萎凋过程中减少了80%[9]。有研究显示在茶叶的热水浸提过程或茶饮料的加热过程，GBVs发生非酶促水解反应[18]。萎凋过程细胞失水以及干燥的热力作用促使了苯乙基樱草糖苷的非酶解反应，增加了白茶中的苯乙醇。另外，有研究显示苯丙氨酸在萎凋过程大量增加[9,19]。苯丙氨酸是苯乙醇和苯甲醇的前体物质。苯丙氨酸被苯乙醛合酶催化形成苯乙醛，通过芳基脱氢酶转化为苯乙醇[18,20]。由此推测苯乙醇的主要来源为苯丙氨酸转化，其次为非酶促樱草糖苷水解途径。前人研究表明苯甲醇在萎凋过程显著增加[9,21]。本研究显示苯甲醇在鲜叶和白茶中含量无显著差异，这可能是干燥造成苯甲醇损失。苯甲醇糖苷在白茶过程基本保持稳定[9]，其来源于糖苷水解可能性小，说明白茶中苯甲醇来源于苯丙氨酸途径，但烘干的热力作用减少了苯甲醇。

王荣秀发现水杨酸甲酯在白茶萎凋过程呈线性增长趋势[22]，这与本研究结果相同。水杨酸甲酯糖苷在绿茶加工过程整体呈增加态势，萎凋后含量小幅增加，杀青揉捻后含量大量增加[23]。水杨酸甲酯葡萄糖苷在红茶加工过程保持稳定[2]。根据其他茶类水杨酸甲酯糖苷的变化结果，推测白茶的水杨酸甲酯葡萄糖苷减少的可能性较小。茶鲜叶萎凋过程，叶片受到失水胁迫，水杨酸羧基甲基转移酶催化水杨酸生成水杨酸甲酯[22]。水杨酸酯化是白茶的水杨酸甲酯富集的主要来源。综上，根据糖苷类香气成分的形成途径推测樱草糖苷酶解作用对这些香气形成贡献较小，而CsGH1BG6和CsGH1BG21编码的β-葡萄糖苷酶对香叶醇和芳樟醇的积累略有贡献。