茶园土壤微生物群落结构研究进展与“茶-草-菌”技术应用展望

黄小云，黄秀声，韩海东

(福建省农业科学院农业生态研究所/福建省丘陵地区循环农业工程技术研究中心，福建 福州 350013)

茶叶中含有多种营养成分如茶氨酸、茶多酚、咖啡碱、维生素等，具有提神醒脑、降压降血糖、抗老防衰、杀菌防癌等保健功能，是世界“三大无酒精饮料之一”，也是21世纪最健康的饮料之一[1]。茶树是我国的重要经济作物之一，茶叶种植面积和干毛茶产量均稳居世界第一。

茶树的原产地在中国云南。茶树是多年生植物，喜温怕寒、喜酸耐铝怕碱、喜光怕晒、喜湿怕涝[1]，形成了独特的茶园土壤生态系统。茶树每年修剪的凋落物均留园中成为茶园土壤的腐殖质，使茶园土壤积累大量的铝离子酸化土壤，导致土壤中某些养分的缺乏；茶树根系不断地向土壤中释放分泌物，对根系造成逆境胁迫、自毒作用，进而影响茶树生长发育[1-2]。土壤微生物是在复杂的土壤-植物生态系统中最活跃和具有决定性影响的组分之一，在生态系统中积极参与物质和能量循环，而且直接影响土壤的生物化学活性及土壤养分的组成与转化，是土壤肥力的重要指标之一[3]。茶树根际是一个由茶树根系、土壤及微生物三者构成的特殊生态系统[4]，其周围聚集了大量的微生物和土壤动物，是茶树和土壤之间物质能量交换最剧烈的区域，是各种养分和有害物质从无机环境进入茶树生命系统参与食物链物质循环的必经通道[5]。国内外学者研究表明在独特的茶园土壤生态系统中，不仅土壤微生物的活动对茶园土壤的理化性状、物质循环、激素合成等因素起着重要作用，而且土壤微生物间的拮抗作用及根际中特定微生物菌株的耐胁迫和防治根腐病等能力，都会直接或间接影响茶树的生长发育和病虫害防治[6-7]。

近年来，土壤微生物构成特征不仅作为评价土壤质量变化的重要指标，而且根际的研究得到世界范围的关注和重视，成为生态学和土壤学等学科的研究热点[8]。利用生物工程技术在分子水平上对植物土壤微生物多样性的研究主要集中在作物和森林，对茶园独特的土壤生态系统中土壤微生物及群落多样性的研究报道较少[9]。

1 茶园土壤微生物主要种类

茶园土壤中主要的微生物群落有三大类，其中以细菌最多，放线菌次之，真菌最少[8]；微生物总量随土层厚度、土壤物理性状、茶树栽培时间而变动，总的分布趋势是根表多于根际、根际多于根外[10-11。

1.1 细菌

细菌个体小、数量大，占微生物总量的70%～90%，是土壤中最活跃的生物因素，分为自养型和腐生型，自养型细菌主要转化矿质养分的存在状态，腐生型细菌则参与土壤有机质的合成与分解，主要类群有假单孢菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和微球菌属(Micrococcus)、气杆菌属(Aerobacter)、硝化螺菌属(Nitrospira)和固氮菌属(Azotobacter)等[12]。

1.2 放线菌

放线菌主要分布在土壤耕作层，约占土壤微生物的6%～15%，虽然数量比细菌少，但其单个丝状营养体比单个细菌大几十倍到几百倍，因此在土壤中生物量接近细菌[12]。主要类群有链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocarelia)和小单孢菌属(Micromonspora)等[13-14]。

1.3 真菌

真菌大多数好气且耐酸，分布在土壤表层的有机质残片或土壤团粒表面，约占土壤微生物的1%左右，由于其菌丝体是放线菌菌丝体的几倍至几十倍，因此，其生物量在土壤中并不少。真菌具有耐酸性和广泛的酶系统，对土壤的熟化起重要作用，是土壤生态系统的分解者[12,15]。其物种丰富、数量庞大，产生的次生代谢物质抗菌活性强，成为天然活性物质的重要来源之一，为发现新型抗生素药物和生物农药提供广阔领域。主要类群有青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、拟青霉属(Paecilomyce)和镰刀菌属(Fusarium)、酵母菌(Yeast)等，酵母菌(Yeast)有假丝酵母(Candida)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、球拟酵母(Torulopsis)[11]。

2 土壤微生物研究方法

2.1 平板培养法

平板培养法的主要原理是将微生物从土壤分离，根据微生物的形态特征和生理生化特性来分析。但是这种方法仅能从固体培养基上分离，表现1%～10%的优势微生物，无法准确评价微生物的多样性，不能得到全面的微生物群落信息[16-17]。

2.2 生物化学方法

2.2.1 磷脂脂肪酸(PLFA)图谱分析法 磷脂脂肪酸(PLFA)图谱分析法的主要原理是磷脂脂肪酸的含量和组成因微生物不同而不同，且随细胞死亡而即刻分解。这种方法虽然对微生物多样性分析较可靠，但提纯难度大，稳定性易受外界条件影响[16]。

2.2.2 生物标记法(Biology) 生物标记法(Biology)的主要原理是通过微生物对95种碳源的利用率大小和代谢速度快慢来表达其结构和代谢功能，但是测定结果易受外界干扰物、种子浓度和微孔板类型的影响，不能表达全部信息[16,18]。

2.3 现代分子生物学方法

2.3.1 随机扩增多态性(RAPD) RAPD的主要原理是随机选取八到十个寡核苷酸作为引物，检测DNA的多样性，群落结构由聚合酶链式反应(PCR)获得的条带数反映；其局限性为要花大量的人力和物力来筛选出能够PCR扩增最多条带的引物序列[16,18]。

2.3.2 限制性片段长度多态性(RELP) RELP的主要原理是利用筛选得到的内切酶将PCR产物进行酶切，再利用琼脂糖凝胶电泳技术将酶切片段分离，根据酶片段的大小、种类、数量的差异被广泛应用于微生物群落的多样性分析。这种方法分析结果准确，但工作量大、任务繁重且没有重复性[16,19]。

2.3.3 扩增片段长度多态性(AFLP) AFLP的主要原理是由聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RELP)相结合的新型DNA检测技术，可鉴别微生物间的亲缘关系和分析菌株间的形态差异，比RAPD和RELP更好揭示微生物系统的多样性；其局限性为AFLP技术虽然既高效又可靠，但对DNA的纯度要求高，花费较大[20]。

2.3.4 变性梯度凝胶电泳(DGGE) DGGE技术是在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶基础上加入变性剂(尿素和甲酰胺)梯度，区分长度相同但序列不同的DNA；该方法具有可靠、可重复、快速、操作简单等优点，是研究微生物群落结构的主要方法之一，不足之处是要求微生物的丰度要超过1%，DNA片段长度要在1 kb以内，且要有DGGE仪器设备[21-23]。

2.3.5 单链构象多态性(SSCP) SSCP的主要原理是利用单链DNA的特异空间结构(一个碱基的差异)，通过非变性PAGE凝胶上电泳，来显示目标DNA的多态性；该方法分辨率高、操作简单，被广泛用于微生物多样性的研究，但由于单链DNA的空间构象不止一种，因此电泳条件及其条带会造成实验误差[24-26]。

2.3.6 荧光原位杂交(FISH) FISH的主要原理是用荧光标记已知序列的单链核酸做为荧光探针与待测样品进行碱基互补配对杂交，再用荧光显微镜等仪器检测杂交荧光的位置，从而将特定基因定位染色体的方法。这种方法快捷、分辨率高，成为微生物研究的重要方法之一。缺点是荧光信号的干扰，杂交信号会因细胞壁的影响而轻度下降，而且并不是DNA的每一片段都能与荧光探针杂交[27-28]。

2.3.7 末端限制酶切片段长度多态性分析(T-RFLP) T-RFLP的主要原理是对末端荧光标记的PCR产物进行限制性酶切的一种分析微生物群落的指纹技术，是一种高效和可重复的技术，可定性定量检测一个微生物群体的特定基因；缺点是PCR易产生差异或误差，片段长度要求在50～500 bp之间检测数据才准确，图谱的数据库有待进一步完善，提高核查准确度[29]。

3 影响茶园土壤微生物群落的主要农业措施

茶树、土壤和土壤微生物构成茶园独特的生态系统。茶园的农业措施如培肥、套种、覆盖等方式都直接影响茶园土壤微生物的丰度和微生物群落的多样性。

3.1 培肥措施对土壤微生物群落的影响

孙海新等[13]研究认为土壤肥沃的茶园根际细菌较多，肥力中等和贫瘠的茶园土壤则真菌较多，放线菌是在贫瘠的茶园土壤中较多；徐华勤[30]研究认为在红壤茶园土壤中长期施肥能不同程度增加茶园土壤微生物整体活性和丰富度，而有机肥与无机肥配施调节了土壤C/N，能提供更适应微生物生活的环境。林斯等[31]研究表明茶园不同培肥措施对根系微生物种的丰富度和多样性都有明显的影响，以“无机肥+有机肥+豆科绿肥”综合培肥模式对土壤生态系统多样性和稳定性最佳，且茶叶产量最高。孙启祥等[32]加入含有微生物制剂的土壤改良剂可使土壤中微生物数量及活性均较对照有不同程度的提高。邢世和[33]研究提出生物有机肥是一种有效的土壤改良剂，富含的有机质和植物成长必需的氮、磷、钾、镁、钙、锌等营养成分及大量有益微生物，能有效地抑制土壤中病原微生物的生长，改善土壤中的微生态区系，从而促进茶树生长。管恩江等[34]研究结果也表明，生物有机肥能够提高茶园土壤微生物数量，改善茶园土壤微生物群体结构，并使茶叶增产，品质提高。

3.2 套种绿肥对土壤微生物群落的影响

绿肥是指可以利用其生长过程中所产生的全部或部分鲜体，直接或间接翻压到土壤中作肥料，或者是通过它们与主作物的间套轮作，起到促进主作物生长、改善土壤性状等作用的作物[35]。在茶园间作白三叶草方面：齐龙波等[36]研究认为有利于提高土壤微生物生物量碳(MB-C)和土壤微生物生物量磷(MB-P)及土壤微生物量，且在三叶草生长旺季土壤微生物量提高得更多；而沈程文等[37]研究得出在幼龄茶园间作4年白三叶草，0～20 cm红壤剖面中土壤有机碳、微生物量碳、全氮、碱解氮、土壤微生物量氮、全磷、有效磷、微生物量磷随土层深度的增加而递减；宋莉等[38]在成龄茶园(茶龄15年)套种白三叶草和黑麦草，研究结果表明处理与对照相比较土壤微生物数量明显增加：细菌数量、真菌数量、放线菌数量分别是1.75倍～2.58倍、1.22倍～1.88倍和1.15倍～1.46倍。封海胜等[39]和郭永霞等[40]的研究结果表明，细菌型土壤向真菌型土壤转化，是土壤肥力衰竭的标志之一。茶园套种圆叶决明不仅能提高茶园土壤细菌、放线菌和固氮菌数量及微生物总数，而且可以显著降低各土层真菌的数量，起到减缓或阻止茶园土壤肥力衰竭的作用。林黎[41]在研究不同草种组合在茶园套种，结果表明组合套种平托花生与百喜草比单独套种平托花生有效降低土壤温度、保持旱季土壤容重和自然水量、提高土壤综合肥力、增加土壤微生物群落数量，有效增加土壤细菌159.64倍、真菌5.63倍、放线菌1.76倍、固氮菌37.1倍，并提高茶叶品质。

3.3 套种食用菌对土壤微生物群落的影响

茶园套种食用菌模式是利用茶园园面空间和土壤环境因地制宜的仿生态栽培适生食用菌，适生食用菌因茶树树龄不同而不同，分为幼龄茶园套种和成龄茶园套种两种模式。间作食用菌使茶园土壤微生物群落结构发生显著变化，无论是土壤微生物群落数量，还是多样性，间作后土壤微生物普遍高于单作[42]。杨云丽等[43]在成龄茶园(云南大叶种茶园，树龄8年)套种平菇(糙皮侧耳)，研究表明：在茶树与食用菌的复合栽培模式下，土壤微生物中细菌数量和放线菌数量的变化情况为：对照组>两年>一年；随着降雨量的变化情况为：细菌数量持续增多，放线菌数量是旱季>雨季>雨季初期；真菌数量是雨季初期>旱季>雨季；李艳春等[2]在10年生茶园中套种灵芝，研究结果表明茶园间作灵芝处理的土壤细菌群落丰度指数和多样性指数与纯茶园相比无显著性差异；间作灵芝处理显著提高了土壤有益微生物菌相对丰度：间作灵芝茶园土壤的变形菌门相对丰度显著提高21.18%，而酸杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度显著降低15.09%和53.52%，其他细菌门类变化不显著。李振武等[44]以1年生幼龄茶园生态系统为研究对象，通过连续4年的冬季茶株行间套种大球盖菇能明显提升茶园土壤有机质含量，减缓土壤酸化进程，增加全氮和速效氮含量，减小土壤容重，改善土壤结构。

3.4 土壤覆盖物对微生物群落的影响

土壤微生物多为有机营养型，茶园修剪物回园和农作物秸秆、绿肥等覆盖物都为土壤微生物提供了有机能源，可以促进茶园土壤微生物的生长，对土壤微生物生命活动有刺激效应。同时在有机物分解过程中，各种有机和无机养分的消长，也必然会引起土壤微生物区系组成的变化，尤其是随着修剪物的腐烂分解，修剪物中的抑菌、抗菌物质的不断释放出来，反过来抑制微生物的生长，导致微生物的数量和种类下降，但由于真菌的抗逆能力较强，影响到土壤中整个生物学过程的活性和强度，两者综合作用的结果促进了土壤中营养物质的循环，使土壤肥力得到补充和更新[45-46]。徐华勤等[30]研究认为稻草覆盖不同程度地提高了微生物整体活性和丰富度。

总之，土壤微生物活性既受土壤环境因子的影响，又通过自身对土壤养分的分解转化作用影响土壤因子，从而影响着土壤养分的有效性、作物对土壤养分的利用能力，以及土壤质量的自我维持能力。土壤微生物数量与有机质、易氧化有机质含量呈极显著正相关，即土壤含有机质、易氧化有机质丰富，土壤微生物数量就多[47]。

4 利用“茶-草-菌”技术构建生态茶园的应用展望

茶园独特的土壤生态系统导致茶园土壤养分缺乏。茶树根系分泌物累积影响土壤微环境，造成土壤微生物的选择性适应，改变茶园土壤微生物组成[48]，使得某些特定微生物类群得到富集，最终改变土壤中微生物种群的平衡[2]。利用微生物的生态功能[49]，构建“茶-草-菌”耦合生态茶园，提高土壤有机质和改善微生物群落。其应用展望有以下三点：

4.1 消除茶园连作障碍

茶园连作障碍问题在生产上主要表现在两个方面：一是在茶树盛产期茶叶产量逐年下降；二是在老茶园更新时新茶苗难成活、成活的茶苗根系不发达，影响茶苗健康成长[50]。克服连作障碍的主要措施有施用化学改良剂(生石灰)、有机肥、生物菌肥、生物质材料和茶园多样性栽培等[2]。通过构建生态茶园，利用茶园套种护坡草(黄花萱草或百喜草)、绿肥(圆叶决明)、食用菌(灵芝)等增加茶园多样性栽培的模式，利用茶园修剪覆盖物和化学改良剂(生石灰)及茶园施肥(有机肥)等诸因子的耦合，以达到增加和丰富土壤微生物群落，改善茶园的土壤生态系统，达到消除连作障碍的目的。

4.2 增加土壤有益微生物群落

生态茶园的立体栽培有套种绿肥和食用菌等方式，而选择合适的套种组合比单一套种更能有降低茶园土壤真菌的数量和提高固氮菌的群落数量，对土壤肥力衰竭起到减缓或阻止的作用，显著提高了土壤有益微生物菌相对丰度[2,41]。因此，选择茶园适生草种及食用菌组合套种的构建“茶-草-菌”立体栽培模式，可以提高和改良茶园土壤有益微生物群落，从而减缓茶园连作造成的土壤肥力衰竭。

4.3 专用生物菌肥研发应用

茶园土壤微生物不仅物种丰富，而且在细菌和真菌中都存在优势门属，其功能也不尽相同[51-53]，如茶树根际有丰富的固氮菌，应用现代科技分离出有益微生物菌株研制成茶树专用生物菌肥，不仅能增强茶树对磷的吸收能力，而且可以促进对矿质营养成分如氮、钾、镁、铜、铁、锌等的吸收，从而增强茶树的抗逆性和抗病虫害能力，达到促进茶树的健康生长和提高茶叶品质目的[11,54-55]。

5 小结

茶园独特的土壤生态系统决定了土壤微生物的种群及数量，通过人为的干扰即应用如“茶-草-菌”的立体栽培技术模式构建生态茶园，改变微生物的种群及数量，改良茶园土壤的理化性状，促进茶树体内的物质循环、激素合成，进而促进茶树的生长发育和病虫害防治。因此，通过对生态茶园土壤微生物的研究，不仅为生态茶园提供科学理论支撑，而且有助于茶园生态建设在山地茶园推广应用，为茶园克服连作障碍、增强茶树抗病虫害、提高茶叶产量和品质具有重要的意义。