不同凝固剂对大豆分离蛋白分子间作用力及蛋白质二级结构的影响

戴意强，刘小莉，吴 寒，尹丽卿，周剑忠，董明盛，夏秀东,

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京 210014；2.南京农业大学食品科学技术学院，江苏南京 210095）

大豆营养价值高，含丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物，此外，钙、铁、磷等微量元素丰富[1]。大豆可以被加工成各种豆制品，其中最受消费者欢迎的豆制品是豆腐。在豆腐制作过程中，点浆会影响最终产品的品质，是大豆蛋白形成凝胶过程中最关键的步骤。在该过程中，涉及的分子间作用力主要有共价键（二硫键）以及疏水作用和静电作用等非共价作用。生豆浆中蛋白质的亲水基团位于分子外部，而疏水基团位于分子内部，此时蛋白结构稳定。在煮浆过程中，由于温度的升高，蛋白质分子运动加剧，疏水基团暴露，氢键被破坏，蛋白质发生变性[1]。凝固剂的加入可以进一步促使蛋白质分子间作用力改变，形成不溶性蛋白聚集体。

目前，被广泛应用的豆腐凝固剂有MgCl2、CaSO4等盐类凝固剂和葡萄酸-δ-内酯（glucono-δ-lactone，GDL）、醋酸等酸类凝固剂[2]。盐桥理论是解释盐诱导大豆蛋白凝固机理的主要理论[3]。盐类凝固剂在大豆蛋白溶液中解离并释放Mg2+、Ca2+等阳离子，通过屏蔽蛋白质的表面负电荷以减少蛋白质分子之间的静电斥力，并与蛋白分子结合，充当“桥梁”的作用[4−5]。酸类凝固剂诱导大豆蛋白凝固的机理主要是酸类凝固剂可以降低蛋白溶液的pH，当pH 接近大豆蛋白等电点时，蛋白质表面负电荷减少，疏水作用和二硫键含量增加，蛋白分子间静电斥力下降，导致蛋白质发生聚集形成凝胶[6−7]。尽管目前对蛋白质凝胶过程中涉及的分子间作用力有所报道，但对不同凝固剂诱导蛋白聚集的分子间作用力的比较及蛋白质二级结构变化鲜有研究。本文以大豆分离蛋白（Soy protein isolate，SPI）作为研究对象，研究了不同凝固剂（MgCl2、CaSO4、乳酸、醋酸、GDL 和酸浆）对诱导大豆蛋白凝固过程中分子间作用力和蛋白质二级结构的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜黄浆水 由南京豆制品生产企业提供；植物乳杆菌D1031 来自江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程实验室；酸浆（pH4.0） 由黄浆水经植物乳杆菌D1031 在37 ℃条件下发酵24 h得到；MgCl2、CaSO4、乳酸和醋酸 国药集团化学试剂有限公司；GDL 上海瑞永生物科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）和5,5'-二硫代双（DTNB） 上海麦克林生化科技有限公司。

FiveEasy PluspH 计 梅特勒-托利多有限公司；FDU-1200 冷冻干燥机 日本EYELA 公司；T25 分散机 德国IKA 公司；Cytation5 多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；ZSP 纳米粒度电位仪 马尔文仪器公司；J-1500 圆二色谱仪（CD） 日本JASCO 公司；3K15 离心机 美国Sigma 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SPI 的提取 SPI 的制备参照Chen 等[8]报道的方法。脱脂豆粉按照1:15 的料液比加入去离子水溶解，并用2 mol/L NaOH 调至pH 为7.5，25 ℃下搅拌2 h 后，在4 ℃，8000 g 下离心20 min。上清液用2 mol/L 盐酸调至pH 为4.5 后，在4 ℃，8000 g 下离心10 min，此时获得的沉淀用其5 倍质量的去离子水清洗2 次，并于8000 g 离心10 min。沉淀按1:5的料液比加入去离子水后，用2 mol/L NaOH 调至pH 为7.0，经冷冻干燥获得SPI 粉末。利用凯氏定氮法测定冻干SPI 粉末中蛋白质含量为93.62%。

1.2.2 SPI 豆腐的制作 800 mL 5%（w/v）的SPI 溶液煮沸5 min，并于85 ℃保温，缓慢加入凝固剂（3‰MgCl2、3‰ CaSO4、3‰ GDL，20% pH 2.0 乳酸，30%pH 3.0 醋酸或35% pH 4.0 酸浆），制成6 种凝固剂处理的SPI 凝胶。在加入凝固剂0、3、10、20、30、和45 min 后，将SPI 溶液或凝胶迅速放置于冰浴中至其温度降至室温（处理0 min 是指SPI 溶液加入凝固剂后立刻进行冰浴）。另取二分之一的样品冻干，用于游离巯基（SH）和蛋白质二级结构的测定。

1.2.3 pH 的测定 利用pH 计测定加入凝固剂后SPI 溶液的pH 变化。

1.2.4 表面疏水性的测定 SPI 溶液表面疏水性的测定参照Shigeru 等[9]所述方法并做适当修改。SPI 凝胶5000 r/min 匀浆3 min 后，用0.01mol/L pH 7.0 磷酸缓冲溶液（PBS）进行梯度稀释，得到0%～0.05%蛋白浓度的系列溶液，取20 μL 8.0 mmol/L ANS 溶液添加到2 mL 稀释样品中。避光反应20 min后，利用多功能酶标仪测定样品的荧光强度。激发波长和发射波长分别为390 和470 nm，狭缝宽度为10 nm。SPI 表面疏水力指数以荧光强度与蛋白质浓度曲线的初始斜率表示。

1.2.5 游离巯基的测定 SPI 溶液游离巯基的测定参照Zhang 等[10]报道的方法。称取40 mg 冻干样品并溶解于4 mL Tris-Gly 缓冲溶液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly 和4 mmol/L Na2EDTA，pH 8.0）中，并于25 ℃下放置30 min。10000 g 离心20 min后，上清液中加入30 μL Ellman 试剂溶液（4 mg DTNB 溶于1 mL Tris-Gly 缓冲溶液），25 ℃反应15 min 后，在412 nm 处测定吸光值。上清液中蛋白质含量使用考马斯亮蓝法测定。游离巯基含量用以下公式计算：

游离巯基含量=（A412/ε）×D/c

式中：A412表示在波长412 nm 下的吸光值，ε 表示吸光系数（13600 mol−1cm−1L），D 表示稀释倍数，c 表示离心后上清液蛋白浓度（mg/mL）。

1.2.6 Zeta 电位的测定 Zeta 电位的测定参照Liang等[11]所述方法。SPI 凝胶于5000 r/min 匀浆3 min后，用去离子水稀释200 倍，使用电位仪测定SPI 凝胶的Zeta 电位。溶剂为去离子水，折光系数为1.33，介电常数为78.54。

1.2.7 蛋白质二级结构的测定 称取0.1 g SPI 冻干样品，溶于5 mL 去离子水中，利用CD 测定蛋白质二级结构，并利用仪器自带软件模拟蛋白质二级结构（α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规卷曲）的比例。测定条件：0.1 cm 厚度的石英比色皿；190～250 nm 波长扫描；扫描3 次取平均值。

1.3 数据处理

实验数据测定三次，结果用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 22.0 对数据进行分析，多组数据差异性分析采用Duncan 比较模型，差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同凝固剂对SPI 溶液pH 的影响

由图1 可知，乳酸、醋酸和酸浆能降低SPI 溶液的pH，并在3 min 内达到稳定，而加入GDL 的SPI 溶液pH 在10 min 之内达到稳定，为5.40～5.48，这与Cao 等[12]的研究一致，即加入0.30 g/100 mL GDL 的豆乳凝胶的最终pH 为5.42。盐类凝固剂的加入也会降低SPI 溶液的pH，这可能与凝固剂中Ca2+和Mg2+与植酸作用有关[13]。值得注意的是，加入酸类凝固剂的SPI 溶液的pH 显著低于加入盐类凝固剂的SPI 溶液。Hsia 等[14]研究表明大豆蛋白7Sα′、7Sα、7Sβ、11S A1a、11S A1b、11S B1a、11S B1b、11S A2、11S A3 和11S A4 的等电点分别为5.23，5.07，5.88，5.78，5.28，5.46，5.73，5.46，5.60 和5.29。MgCl2和CaSO4的加入虽然能使SPI 溶液pH 降低，但与大豆蛋白的等电点相差较大，因此盐类凝固剂导致的SPI 溶液pH 的降低不是大豆蛋白聚集的主要原因。pH 的降低减弱了蛋白质分子之间的静电斥力，有利于蛋白质聚集，而Ca2+和Mg2+以“盐桥”的方式与蛋白质分子结合，形成大豆蛋白凝胶[15]。

图1 不同凝固剂诱导SPI 溶液pH 的变化Fig.1 Changes of pH value of SPI solution induced by different coagulants

2.2 不同凝固剂对SPI 溶液表面疏水作用力的影响

蛋白质分子间的疏水相互作用会导致蛋白质的随机聚集和凝胶形成，亚基的解离和多肽链的展开都能引起疏水作用力的升高，因此表面疏水作用力的变化在一定程度上能够反映蛋白质聚集过程中的结构变化[16]。由图2 可知，与仅热处理的SPI（312.94）相比，加入凝固剂的SPI 溶液表面疏水作用力显著增加（P<0.05）。MgCl2和CaSO4引起SPI 溶液中离子强度增加，并改变蛋白质分子的空间结构，隐藏在SPI 内部的疏水区域暴露出来，导致蛋白疏水性增加[17]。乳酸、醋酸、GDL 和酸浆会降低SPI 溶液的pH，当溶液pH 接近蛋白质的等电点时，蛋白的表面电荷和溶解度均降低，空间结构发生改变，进而引起蛋白表面疏水作用力升高，蛋白质发生聚集。随着凝固剂加入时间的延长，SPI 溶液表面疏水性逐渐降低，这可能是因为暴露出来的疏水基团由于疏水性聚集，导致疏水基团再次被包埋在蛋白聚集体内部[18]，此外，当蛋白质的疏水区域靠近带电荷的侧链残基，静电相互作用会影响探针与蛋白质的结合，从而影响蛋白质疏水作用力[19]。特别的，GDL 诱导的SPI 凝胶表面疏水性在45 min 内持续下降，这可能与GDL 缓慢释放H+导致蛋白质缓慢聚集有关。

图2 不同凝固剂诱导SPI 溶液表面疏水作用力的变化Fig.2 Changes of surface hydrophobicity of SPI solution induced by different coagulants

2.3 不同凝固剂对SPI 溶液中游离SH 含量的影响

物理和化学处理可使蛋白质构象改变并影响SPI 溶液中SH 基团含量，因此，游离SH 含量可作为添加凝固剂后SPI 变性程度的评价指标[20]。与仅热处理的SPI（4.28 μmol/g 蛋白质）相比，凝固剂处理的SPI 溶液中游离SH 含量显著增加（P<0.05），这可能是因为来自盐类凝固剂的Ca2+、Mg2+和酸类凝固剂产生的H+与蛋白质分子上带负电荷的基团结合[16,21]，导致蛋白质多肽链的展开，隐藏于蛋白质分子内部的巯基暴露。大豆11S 蛋白酸性多肽链和碱性多肽链通过二硫键连接，凝固剂的加入可能会导致二硫键的断裂，从而引起SPI 溶液中游离SH 含量的增加。由图3 可知，在加入凝固剂0～45 min 内，SPI 溶液中游离SH 含量持续减少（图3），这是由于在高温条件下，暴露的游离巯基氧化反应形成二硫键[22]。

图3 不同凝固剂诱导SPI 溶液中游离巯基含量的变化Fig.3 Changes of free sulfhydryl of SPI solution induced by different coagulants

2.4 不同凝固剂对SPI 溶液Zeta 电位的影响

Zeta 电位通常被用来测定蛋白表面电荷性质，并可以作为评价蛋白质胶体稳定性的指标[23]。Zeta 电位绝对值越高，表明体系中静电斥力越强，胶体系统越稳定[24]。加热处理后的SPI 溶液Zeta 电位绝对值从30.37 mV 降低至22.43 mV，表明加热后的SPI 溶液中蛋白质粒子稳定性下降。当加入凝固剂后，SPI 溶液的Zeta 电位进一步降低。当胶体体系中Zeta 电位绝对值低于10 mV，胶体体系中的粒子趋向于聚集[23]。如表1 所示，与仅加热处理的SPI 溶液相比，向SPI 溶液中加入凝固剂会释放金属离子（如Ca2+或Mg2+）或H+，中和变性蛋白质表面的负电荷，导致蛋白质分子之间的静电斥力降低，Zeta 电位的绝对值下降[25]。

由表1 可知，加入凝固剂的SPI 溶液的Zeta 电位在短时间达到稳定，这表明凝固剂能快速破坏蛋白质分子间的静电斥力，且该过程对蛋白质稳定性的破坏是不可逆的。此外，加入MgCl2、乳酸和醋酸的SPI 溶液的Zeta 电位在极短时间内达到稳定，这可能与MgCl2、乳酸和醋酸诱导蛋白凝固速率快有关。GDL 诱导的SPI 凝胶的Zeta 电位在10～20 min内由负变正，这是因为GDL 可在SPI 溶液中缓慢释放H+，使得最终SPI 溶液呈正电价[5]。与其他凝固剂处理的SPI 相比，加入酸浆的SPI 溶液的Zeta 电位绝对值最大，这可能与酸浆中的复杂组成有关。Li 等[26]研究表明酸浆中含有大量有机酸、可溶性蛋白质、氨基酸、脂质、可溶性糖、维生素和矿物质等。以上研究结果表明，不同凝固剂的加入均会降低蛋白质分子间的静电斥力，使SPI 溶液趋于不稳定，促使蛋白质的聚集并产生沉淀。

表1 不同凝固剂诱导SPI 溶液Zeta 电位的变化Table 1 Changes of zeta potential of SPI solution induced by different coagulants

2.5 不同凝固剂对SPI 溶液蛋白质二级结构的影响

表2 为不同凝固剂对SPI 溶液中α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规卷曲比例的影响。与仅热处理的SPI 二级结构（α-螺旋=26.4%，β-折叠=6.0%，β-转角=5.4%，无规卷曲=62.2%）相比，加入盐类凝固剂的SPI 的α-螺旋和β-转角的比例降低，而β-折叠的比例增加，这可能是因为盐类凝固剂可以通过改变氢键位置将α-螺旋和β-转角转变成β-折叠[27]。乳酸和醋酸可以完全破坏SPI 中α-螺旋和β-折叠，加入醋酸和GDL 的SPI 的β-转角的比例降低。特别地，加入GDL 的SPI 的α-螺旋比例在0～30 min 内从24.9%逐渐降低到0，这可能与GDL 在SPI 溶液中缓慢释放H+有关。添加酸浆的SPI 的α-螺旋比例介于加入乳酸和盐类凝固剂的SPI 溶液之间，而β-转角比例介于加入乳酸和醋酸的SPI 溶液之间，这是因为酸浆中主要的有机酸是乳酸和醋酸[28]，此外还含有一定量的盐离子，这些物质共同作用于蛋白质并表现出与单一盐类凝固剂和酸类凝固剂不同的规律。

表2 不同凝固剂诱导SPI 溶液蛋白质二级结构比例的变化（%）Table 2 Changes of secondary structure percent of SPI induced by different coagulants (%)

金属离子（如Ca2+或Mg2+）和H+可以中和蛋白质表面电荷，破坏蛋白质分子之间的静电作用和多肽链上-CO 和-NH 之间氢键的稳定性，导致SPI 的蛋白质二级结构发生变化[29]，并降低SPI 中α-螺旋比例。

2.6 盐类凝固剂和酸类凝固剂对SPI 结构变化的影响

7S 蛋白和11S 蛋白是SPI 中主要的蛋白成分，分别呈现三聚体结构和六聚体结构。7S 蛋白和11S 蛋白的变性温度分别在65～75 ℃和85～95 ℃[15]。本文SPI 溶液煮沸并在85 ℃保温，7S 蛋白和11S蛋白完全变性，大豆蛋白亚基解离，稳定的球状结构被打开，转变为伸展状态[30]（图4），并在氢键、疏水作用力和静电作用力等分子间作用力下形成可溶性聚集体[31]。高温会破坏大豆蛋白质分子的三级结构但对蛋白质的二级结构影响较小[32]。

图4 不同凝固剂诱导大豆蛋白SPI 胶凝形成的机理模型Fig.4 Reaction scheme of different coagulants inducing SPI aggregation

盐类凝固剂（MgCl2、CaSO4）和酸类凝固剂（乳酸、醋酸、GDL 和酸浆）的加入会导致蛋白质疏水基团和巯基暴露，蛋白质分子之间静电斥力降低，但随着反应时间增加，蛋白质分子则会发生不同程度的疏水聚集，且游离巯基氧化形成二硫键。在这些蛋白质分子间作用力的共同作用下，大豆蛋白形成不溶性聚集体。盐类凝固剂可以以“盐桥”的方式连接大豆蛋白分子，将蛋白质二级结构的α-螺旋和β-转角转变成β-折叠。酸类凝固剂降低蛋白溶液的等电点，破坏了蛋白质β-转角，并诱导蛋白质发生聚集。

3 结论

在大豆蛋白凝胶形成过程中，盐类凝固剂和酸类凝固剂均能降低SPI 溶液的pH，但加入盐类凝固剂的SPI 溶液的pH 降幅小于酸类凝固剂。与仅热处理的SPI 溶液相比，加入凝固剂的SPI 溶液表面疏水作用力和游离SH 含量增加，而Zeta 电位降低；但不同凝固剂对SPI 蛋白质二级结构的影响具有一定差异，盐类凝固剂会促使SPI 的α-螺旋和β-转角转变为β-折叠，酸类凝固剂则会破坏SPI 中β-折叠。本文可为研究复合凝固剂诱导大豆蛋白凝胶机理提供一定的基础，并对比较不同凝固剂作用下的大豆蛋白聚集和凝胶行为具有参考意义。