秋季东北地区奶牛舍内环境中微生物气溶胶分布规律比较研究

李 晏，孙宏起，刘 明，李佃场，郭振东*，刘静波*

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130122；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；4.青岛市即墨区畜牧业发展服务中心，山东青岛 266200）

当前我国集约化的高密度畜禽饲养模式使得畜禽舍内气溶胶浓度升高，环境中病原微生物浓度增加，给相关从业人员和动物本身带来健康风险[1-3]。陈冠希等[4]研究表明，猪舍空气颗粒物处理的小鼠肺部发生了明显的病理性损伤和严重的炎症反应。刘传德[5]研究发现，微生物气溶胶的粒径越小越易进入动物的呼吸系统从而引发疾病。前人研究表明奶牛舍内气溶胶浓度随季节变化而变化，且早晚存在一定的差异性[6]。奶牛舍内微生物气溶胶中总细菌浓度白天均高于夜晚，春季均高于夏季[7-8]。Wolinsky[9]研究表明，鸡舍内气溶胶中气载需氧菌含量增高能够影响动物免疫力，但奶牛舍内气载需氧菌含量增高对于奶牛免疫力的具体影响目前尚不明确。在空间上，由于通风结构及重力的影响，同一养殖场内不同位置、不同高度的气溶胶浓度和微生物分布组成也可能存在一定的差异[10]。本研究通过在吉林地区一家奶牛养殖场奶牛舍内不同位置、不同高度开展秋季连续4 个月的监测采样，比较秋季奶牛舍内气溶胶颗粒浓度在同一位置不同高度的差异，分析秋季奶牛舍内气载需氧菌含量在同一位置不同时间的差异及分布规律，为进一步评估奶牛饲养环境、减少疾病传播提供数据参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 监测奶牛舍基本情况 试验于吉林长春某奶牛养殖场选择1 个成年奶牛舍，奶牛舍内选取5 个采样点（图1）。奶牛舍为半封闭拴系式，舍内基本无采暖措施，仅靠夜晚封闭牛舍保温，采用双坡屋顶结构，舍内采光为自然采光和人工照明相结合的方式，斜向风扇通风与自然通风相结合，舍长80 m、宽10 m、高5 m（图2）。舍内饲养成年奶牛90 头，奶牛自由采食，每天挤奶3 次，3 次投料、2 次整理卧床，清粪方式为铲车清粪，每日1 次。在11 月和12 月，为实现保暖而在奶牛舍内铺设垫料，砂土作为卧床主要垫料。

图1 奶牛养殖场内采样点分布图

图2 奶牛养殖场截面图

1.2 奶牛舍空气样品采集方法 于2016 年9—12 月在奶牛舍内5 个采样点分别距地面 0.5、1.0、1.5 m 处采用激光粒子计数器（9306-V2 型号；提赛环科仪器贸易有限公司）监测气溶胶颗粒物粒径大小和浓度，截取粒径范围分别为0.3～0.5、0.5～1.0、1.0～3.0、3.0～5.0、5.0～10 μm和＞10 μm；采用安德森6 级微生物气溶胶采样器采集空气样品进行需氧菌含量测定，截取粒径范围如表1 所示。

表1 安德森6 级采样器技术参数

1.3 气溶胶颗粒物浓度测定 采用激光粒子计数器监测奶牛舍内不同采样点及不同高度（0.5、1.0、1.5 m）处的气溶胶粒径分布及浓度，每个高度重复5 次，单次20 s，每次使用前将数据归零重置，测得0.94 L 空气中的气溶胶颗粒物粒径大小及数量。同时记录奶牛舍环境卫生情况，使用TSI 温湿度风速仪9545-A 测量采样时的温度、湿度、风速。

1.4 气溶胶中需氧菌数量测定 在2016 年9—12 月，使用哥伦比亚血琼脂培养基为安德森6 级采样器（美国Tisch Environmental Inc 有限公司）中的采样介质，于每月10 号在奶牛舍内采样点距离地面1.0 m 处进行样品采集工作，确保周遭无工作人员活动，每个点重复采样3 次，时间为3 min，空气流量为28.3 L/min。将已吸附气溶胶样品的培养基，6 个一组做好标记。将所有培养基统一收集起来，放入恒温培养箱中倒置培养1～2 d后，统计培养基上的菌落数量。通过ANDERSON 校正表进行校正从而计算出气载需氧菌菌落数量的校正总和。根据采样器的采样流量（28.3 L/min）和采样时间计算出奶牛舍内环境中气载需氧菌浓度。

1.5 统计分析 奶牛舍内环境中的气载需氧菌浓度按公式计算：

其中，C表示气载需氧菌浓度（CFU/m3）；t表示采样时间（min）；F表示采样器的采样流量（为28.3 L/min）；N1～N6为安德森六级采样器上每层校正后的气载需氧菌菌落数量。

当微生物气溶胶粒子粒径小于5.0 μm 时，易进入人体呼吸道，可计算吸入的气载需氧菌浓度的百分比，计算公式：

其中，P表示可吸入气载需氧菌浓度的百分比；N1～N6表示安德森六级采样器上每层校正后的气载需氧菌菌落数量。

使用SAS 软件和Graphpad Prism 5.0 对数据进行统计学分析并作图，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 秋季奶牛舍内气溶胶颗粒物浓度分布规律 舍内环境状况如表2 所示。从图3 可以看出，秋季奶牛舍内气溶胶颗粒物浓度与各采样点距离地面高度（＜1.5 m）无直接关系。9 月奶牛舍内点5 和点2 在距离地面0.5 m处的气溶胶颗粒物浓度为最高和最低，每升空气中的气溶胶粒子数量分别为1.96×105个和1.410 27×105个；10 月奶牛舍内点2 和点5 在距离地面1.0 m 处气溶胶颗粒物浓度最高和最低，每升空气中的气溶胶粒子数量分别为1.31×105个和1.00×105个；11 月奶牛舍内点4 在距离地面1.5 m 处气溶胶颗粒物浓度最高，其点3 在距地面0.5 m 处的气溶胶颗粒物浓度最低，每升空气中的气溶胶粒子数量分别为2.53×105个和1.75×105个；12 月奶牛舍内点4 在距地面1.0 m 处的气溶胶颗粒物浓度最高，其点1 在距地面0.5 m 处的气溶胶粒子浓度最低，每升空气中的气溶胶粒子数量分别为2.65×105个和2.19 ×105个。同一个月内其余各点之间气溶胶颗粒物浓度差异不显著。所以在9—12 月中奶牛舍内气溶胶粒子浓度与采样点距离地面高度（＜1.5 m）无直接关系（配对样品T 检验，相关系数（P＞0.05）。

表2 舍内环境状况

从图4 可以得出，在不区分高度的情况下，4 个月中，10 月奶牛舍内各点的气溶胶粒子浓度最低，12 月时最高，相当于10 月各点浓度的2 倍。从表2 中可得，12 月奶牛舍内温度和卫生状况较10 月大幅下降，湿度显著上升，通风条件变差。11 月与12 月间气溶胶粒子浓度差异显著，其余各月之间气溶胶粒子浓度差异极显著。从图3-B 至3-D 中可以看出，10 月奶牛舍内P5 处气溶胶粒子浓度最低，12 月P3 处的气溶胶粒子浓度最高。秋季奶牛舍气溶胶粒子浓度随时间变化，气温降低和湿度升高而升高。

图3 秋季不同月份奶牛舍内不同采样点及采样高度的气溶胶颗粒物浓度

图4 秋季不同月份气溶胶粒子浓度

如图5 所示，奶牛舍内气溶胶粒子浓度随着粒子粒径的增大而降低。选取奶牛舍内气溶胶粒子浓度差异最大的10 月与12 月进行对比，两者均在气溶胶粒子粒径为0.3～0.5 μm 时浓度最高，而在粒径＞10.0 μm 的气溶胶粒子浓度最低，两者之间差异极显著（图5 和图6）。当粒径在3.0～5.0 μm 和5.0～10.0 μm 时，10 月与12 月奶牛舍内气溶胶粒子浓度大致相等。

图5 10 月与12 月不同粒径范围内的气溶胶粒子浓度趋势

图6 10 月不同粒径的气溶胶颗粒物浓度百分比

2.2 秋季奶牛舍内气溶胶中需氧菌丰度的影响 从图7可以看出，奶牛舍内气溶胶中气载需氧菌浓度随月份增加呈先降低后升高的变化趋势。在4 个月中，点1 处采集的气溶胶中气载需氧菌浓度明显高于其他各点，9 月时最高为1.36×104CFU/m3，点3 处则明显低于其他各点，10 月最低为0.84×104CFU/m3。从表3 中可以看出，在相同体积的空气中，粒径＜1 μm 时测得舍内气溶胶粒子数最高，粒径＞10 μm 时气溶胶粒子数最低。从图8-A 可以看出，采集到的各组气溶胶中气载需氧菌菌落数量由高至低。气载需氧菌菌落数量在总菌落数中占比最大为22.23%，位于第4 级，最小为7.38%，位于第6 级。

表3 采样点1 处84.9 L 空气中气 溶胶粒子数与菌落数量

图7 气载需氧菌浓度随月份变化趋势图

从图8-B 可以看出，在可培养细菌中，生长于粒径＜5.0 μm 的微生物气溶胶上的细菌丰度明显高于生长于粒径＞5.0 μm 的细菌丰度。粒径＜5.0 μm 的微生物气溶胶更易随空气进入呼吸道，在动物和人身体的不同部位沉积。以每分钟吸入微生物的CFU 表示，根据人的吸气量（6.94×10-3m3/min），饲养人员在牛舍内每小时可吸入2.45×103～3.60×103CFU 空气细菌。

图8 不同气溶胶粒径气载需氧菌菌落数量百分比

3 讨 论

本研究中随月份改变，气温降低，奶牛舍内环境湿度增加和卫生状况变差，气溶胶粒子浓度升高，这与高玉红等[11]的研究结果一致。本研究中奶牛舍内气溶胶粒子浓度差异最大的为10 月与12 月，12 月由秋季向冬季转变，奶牛舍门窗关闭，封闭程度较高，奶牛舍内垫料增加，10 月舍内平均风速为0.06 m/s，而12 月为0.02 m/s，通风性能相对较差，从而引起舍内气载微生物数量和气溶胶粒子浓度增加，这与单春花等[12]的研究结果相似。高玉红等[13]研究显示，不同建筑类型和不同时间段牛舍内微生物数量均表现出显著性差异；Islam 等[14]研究表明，奶牛舍内外的温度和气流强度会影响微生物气溶胶的传播，Kristina 等[15]研究显示，奶牛舍内顺风处与逆风处的空气中真菌浓度差异显著。本研究选取同一生长阶段的奶牛，奶牛舍建造采用双坡屋顶结构，半封闭栓系式，较大程度限制了奶牛的活动范围，舍内环境较为阴暗避光，机械通风与自然通风相结合，舍中央细菌浓度相对于4 个角落更高。本研究结果显示，奶牛舍内气溶胶粒子浓度与距离地面高度（＞1.5 m）无直接关系，由于试验高度限制于当时饲养环境高度和时间条件，此结论有待进一步研究论证。单春花等[12]研究发现，不同季节散养式奶牛舍内气载需氧菌总数达到1 804～ 4 944 CFU/m3，与空气中PM10 浓度之间存在显著的线性正相关关系，而本研究结果显示秋季奶牛舍内气溶胶中粒径＞10.0 μm 的粒子浓度在10 月最低，12 月最高，舍内气载需氧菌浓度呈先上升后下降的趋势。这可能是因为研究所选择的奶牛舍饲养条件不同，栓系式奶牛舍细菌密度一般显著高于散养式奶牛舍[16]；而且取样时间不同，本研究取样时间跨度更小，奶牛舍内气溶胶颗粒粒径范围更广，温度变化更小。因此本研究发现奶牛舍气溶胶菌落总数随环境温度的降低而下降，这与单春花等[12]研究结果一致。本试验结果显示奶牛舍内可吸入细菌丰度相较于非可吸入细菌差异极显著，刘敬博等[17]使用培养计数法测得奶牛舍内气载微生物（细菌和真菌）含量的平均值为2.09×105 CFU/m3，同时使用DAPI 染色计数法测得奶牛舍内气载微生物含量的平均值分别为8.36×106CFU/m3，2 种方法差异极显著。本试验中仅使用安德森6 级微生物采样器和培养基进行可培养细菌的检测，统计得出气载需氧菌的百分比含量，测得奶牛舍内秋季气载需氧菌含量最高为1.36×104CFU/m3，低于我国《畜禽场环境质量标准》（NY/T 388-1999）所规定的牛舍气载需氧菌含量2.0×104CFU/m3的标准，同时低于段会勇等[18]检测的牛舍中气载需氧菌的浓度8.90×104～4.19×105CFU/m3，可能与所测动物生长阶段相关[19]，本研究未使用DAPI 染色计数法测定微生物总含量，容易低估空气中生物气溶胶总量[20]。然而奶牛舍内气溶胶中的可吸入细菌容易造成多种呼吸道传染病，同时可降低长期处于此环境中的技术人员和动物的免疫力，对饲养人员生命健康有着严重威胁[21]。因此，在养殖过程中需重视对微生物气溶胶浓度的监测，未来应建立完整的畜禽舍致病微生物采集和分析标准，同时投入对生物净化剂和吸附剂的研究，促进环境友好型生态养殖。

4 结 论

本研究结果显示，当奶牛舍内的采样点距离地面高度＜1.5 m 时，气溶胶颗粒物浓度与高度无直接关系；秋季的4 个月中奶牛舍内气溶胶浓度变化趋势相同；随气温的降低和相对湿度的增加，气溶胶粒子浓度增加；奶牛舍内气溶胶粒子浓度随着粒子粒径的增大而降低；秋季奶牛舍内微生物气溶胶中可吸入细菌丰度高于非可吸入细菌，奶牛舍内气载需氧菌浓度随月份增加，舍内温度降低及垫料增加而呈先降低后上升的变化趋势，环境因素对奶牛舍内微生物气溶胶浓度变化具有明显影响。