抗菌肽Protegrin-1 的研究进展

施益如，李 暄，蔡明烩，段玉婉，刘璨颖

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231）

近年来，抗生素的滥用导致细菌耐药性增强，开发新的抗菌物质成为应对日益增长的耐药性病菌的重要途经[1]。抗菌肽是生物体内产生的小分子活性多肽，是机体天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽不易使病原微生物产生耐药性，在机体抵抗外源病原微生物入侵过程中发挥重要作用，因此在医药开发、动植物抗病及治疗中具有广泛的应用价值。防御素和Cathelicidin 是哺乳动物抗菌肽中非常重要的两大家族，Protegrins 是猪源Cathelicidin 家族的重要成员之一[2-3]。Protegrins家族已鉴定出5 个含有16～18 个氨基酸的天然多肽，即PG1 到PG5，Protegrin-1（PG1）因其有效的抗菌活性和体内的稳定性为人们所关注[4-5]。PG1 具有广谱抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌等多种传播性病原体作用[6]。PG1 制品作为畜禽无抗饲料的添加成分，将有广阔的应用前景[6-7]。本文综述了PG1 的分子结构、功能作用、表达调控因素和在临床实践中的应用，阐述其发挥生物活性的机制和潜在的应用价值，并对今后PG1的研究方向进行展望，为生产中抗菌肽PG1 的进一步开发和应用提供参考。

1 PG1 的分子结构

PG1 的分子量约3.1 ku[8]，包含18 个氨基酸（RGGRL CYCRR RFCVC VGR），还含有高含量的半胱氨酸（Cys）以及带正电荷的精氨酸（Arg）残基，Miyasaki 等[9]的X-射线衍射研究实验表明，PG1 具有2 个分子内二硫键（Cys6-Cys15 和Cys8-Cys13），C 端酰胺化。PG1 呈“发夹式”分子构型，含有β-转角链接而成的双链反平行式β-片层二级结构，中间为疏水区域，两端为亲水区域，PG1 可以与细胞膜上的阴离子发生交互作用[6]。二硫键对PG1β折叠结构的稳定提供了强有力的束缚力，可以有效限制带正电荷高度亲水的精氨酸，β折叠结构中大量的疏水性残基使PG1 和其他抗菌肽具有相似的两亲性[10]。而抗菌肽在氨基酸序列和结构上有显著差异，但大多数是阳离子。它们可以采用两亲性构象，容易与细菌细胞表面的负电荷成分相互作用，并整合到脂质双层中[11]。

2 PG1 的基因表达

2.1 PG1 在体内的表达特性 PG1 的表达是在骨髓细胞分化的过程中进行，其主要在动物的骨髓干细胞和外周血淋巴细胞中表达；在胸腺、肝、淋巴结等组织中也有表达，PG1 在猪的肺脏和小肠组织中表达量相对较低；在成熟的嗜中性细胞中几乎不表达[12]。除在不同的组织中表达有差异之外，PG1 在不同品种动物中的表达也存在一定差异。PG1 在民猪和长白猪的胸腺、脾脏、肝脏和心脏中表达量较高，而在空肠、回肠、舌和淋巴结中表达量较低，且PG1基因在民猪体内大部分组织中mRNA 表达量都高于长白猪[13]。

2.2 影响PG1 表达量的因素

2.2.1 断奶及仔猪日龄对PG1 表达的影响 断奶可显著降低仔猪中PG1 的表达，表达量下降可能与仔猪免疫系统发育有关，断奶后各免疫组织（如仔猪股骨骨髓）中抗菌肽PG1 的表达水平显著下降[14]。抗菌肽PG1 在仔猪免疫组织中的表达量随着仔猪日龄增加而表现出一定规律，出生时最低，随着日龄增加其表达显著增加，断奶时显著下降，随着断奶日龄的增加其表达又呈上升趋势[14-16]。也有研究表明，PG1 的表达随着仔猪体重的增加及免疫系统的完善呈现出一定的生物学发育规律，表达量先增加后降低[15-16]。

2.2.2 复合多糖对PG1 表达的影响 牛膝、玄参、杜仲黄芪、白术等多种复合多糖对断奶仔猪骨髓抗菌肽PG1mRNA 的表达有明显促进作用，并呈一定剂量效应[17-20]。不同剂量的牛膝多糖对断奶仔猪骨髓PG1mRNA 的表达均存在不同程度的促进作用，并呈非典型的剂量依赖关系[17]。黄芪多糖肌肉注射于猪体内可使PG1 的表达量升高；黄芪组猪的体内PG1 基因表达水平高于对照组，且黄芪的粒度与作用效果呈负相关[18-19]。白术中含有大量可显著上调动物体免疫功能的多糖，PG1基因调控模块中存在多糖调控位点，推测白术对PG1 的表达也有调控作用[20]。

2.2.3 微生物对PG1 表达量的影响 在外源致病因子的刺激下，机体内PG1 的表达量会发生改变，如当猪患蓝耳病时，蓝耳病病毒（PRRSV）攻毒会显著降低PG1 在肺脏中的表达，而PG1 也会抑制PRRSV 的毒性，因此抗菌肽PG1 可用于蓝耳病治疗[15,21]。细菌（如沙门氏菌）、细菌分解产物脂多糖（LPS）、细胞因子白介素（IL-6）和微量养分全反式视黄酸（ATRA）等都能不同程度地促进PG1mRNA 的表达[15-16,22]。在体外骨髓粒细胞培养实验中，LPS 处理后，PG1 的表达水平显著上升，与之相似，IL-6 和ATRA 也能诱导PG1基因显著表达，其机制是在编码PG1的基因启动子区有IL-6 等转录因子的结合位点，而视黄醇（RA）等直接激活PG1 的启动子[12]。而当多黏素B 与LPS 同时存在时，PG1 的表达受到抑制，其具体机制尚不明确[12,15]。

2.2.4 其他因素对PG1 表达量的影响 不同的生理和病理状况及微量元素等均会影响PG1 的表达量，因而通过营养调控增强其表达的方法具有重要意义[6,15]，如金属离子锌和乳铁蛋白等能不同程度地促进PG1mRNA的表达[22]。在饲粮中补充铜可提高血清溶菌酶浓度，推测铜可能参与断奶仔猪骨髓抗菌肽PG1基因的表达调控，从而产生抗菌效果，增强仔猪的抗病力[6,23]。

3 PG1 的生物活性及相关机制

3.1 抗菌活性及相关机制 抗菌肽PG1 具有较好的抗细菌和真菌的活性，能杀死大肠杆菌、绿脓杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、鼠伤寒沙门氏菌、沙眼衣原体和结核杆菌等多种革兰氏阴性菌，能杀灭通过性传播的淋病双球菌和沙眼衣原体，并且对衣原体的作用具有血清型依赖性，相比于抗生素的优势在于不易使细菌产生耐药性[8,24-25]。PG1 对典型革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度为0.12～2 mg/L，低浓度时可明显抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌[26]。PG1 在低离子强度（0.01 mol/L）缓冲液（pH 7.4）中对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有杀菌能力，并且对大肠杆菌的杀微生物活性不受生理浓度的氯化钙和氯化镁的影响[26]。抗菌肽PG1 展现了作为抗微生物制剂用于治疗由临床相关病原体引起的局部或全身性感染的潜力[25]。

抗菌肽（包括PG1）可以选择性地破坏细菌的细胞壁和细胞膜，隔离微生物营养物质或者充当微生物附着的诱饵来杀灭微生物，同时几乎不使微生物产生抗性[27]。PGs 的抗菌活性也与其对微生物膜的扰乱有关。PG1 带有很强的正电荷，可通过静电吸附作用吸附于带负电的细菌细胞膜表面，与细胞膜上的阴离子发生交互作用形成孔道并发生二聚化，形成多聚的二聚体大量聚集，最后形成八聚体跨膜孔道，造成不可控的钾离子和其他分子渗出，随后细胞破裂从而发挥抗菌作用[10]。Knyght 等[28]在Langmuir 膜平衡和中子反射率研究中得出结论，恒河猴θ-防御素1（RTD-1）和猪PG1 在与阴离子脂质单分子膜的相互作用中存在显著差异，两亲性更强的PG1 完全嵌入到脂质膜中，而RTD-1 则以相对较浅的方式相互作用。研究者发现，PG1 可以通过形成阴离子通道而改变爪蟾母细胞膜的通透性[29]。

PG1 的转运能力和抗微生物活性与其成孔能力有关，并依赖于其在β-片层中的折叠，其中β-片层的存在是PG1 结构稳定的关键。PG1 线性化产生的肽载体能够与细胞膜相互作用，但没有分裂膜的活性[30]。PG1在水和二甲亚砜溶液中的核磁共振溶液结构均为单体结构，在模拟膜环境中的2 个单体C 端在β片之间以氢键连接成的二聚体之间的相互连接与孔道的形成有关。高电荷PG1 本身具有诱导分子电穿孔的能力，只要PG1的电荷足够大，在PG1 插入膜中后，就能够首先诱导磷脂双层膜的水柱或孔形成[31]。而精氨酸残基是PG1在膜表面结合的关键，它通过一系列的二齿键网络与脂膜上的磷原子相互作用有利于PG1 的转运[32]。

3.2 抗病毒活性 PG1 对野生型HIV-1 有特异性抑制作用，具有抗人类HIV-1 病毒的活性，它为攻克人类顽疾——艾滋病提供了新的解决途径[33]。PG1 可明显抑制HIV 复制周期的早期，与人Cathelicidin 家族抗菌肽 LL-37 的抗HIV 活性相当，两者还可特异性地抑制慢病毒和逆转录病毒载体活性，但不抑制腺病毒载体的感染性[34]。而在非洲爪蟾皮肤提取的阳离子抗菌肽Magainin-2 及合成肽Modelin1 和Moderln-5 对疱疹病毒HSV-1、HSV-2 有一定的抑制效果，这些抗菌肽不是通过抑制病毒DNA 的复制或基因表达起作用，而是直接作用于病毒被膜[29]。

此外，PG1 可抑制登革热NS2B-NS3 丝氨酸蛋白酶和在MK2 细胞中的病毒复制，从而减少病毒在宿主细胞中的复制，消除登革热病毒的毒性[35]，也对猪繁殖与呼吸综合征病毒有很好的抗病毒效果。PG1 的抗病毒作用发生在HP-PRRSV 吸附宿主细胞过程中，为通过药物治疗增强对猪繁殖与呼吸综合征病毒进行防控提供有力支持[36]。PG1 在对经济动物的病毒感染治疗中也表现出了应用潜力，其对猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145 细胞中的感染和复制有明显的抑制作用，且在体外对Marc-145 细胞没有细胞毒性[36]。

3.3 免疫调节作用 PG1 及其类似物具有良好的免疫调节作用，可与多种细菌内毒素和带负电的荚膜多糖形成复合物，从而抑制巨噬细胞释放炎症介质，其中维持免疫调节作用活性的先决条件是至少有一个用二硫键桥梁稳定的β-发夹结构[37]。PG1 诱导人肥大细胞脱颗粒，从而促使肥大细胞发挥免疫调节作用[38]。成熟的PG1 具有促进肠细胞迁移和免疫调节作用，从而具有组织修复能力，推测PG1 可能对胃肠道炎症性肠综合征有治疗潜力[39]。PG1 及其类似物还可以上调巨噬细胞的特异性吞噬反应，促进T 细胞增殖启动特异性免疫。PG1 与LPS 结合抑制了LPS 的生物活性并阻止其激活TLR4，从而抑制细胞因子TNE-α和IL-1β从巨噬细胞释放。PG1 类似物可中和脑膜炎球菌荚膜多糖聚合物的活性，并抑制IL-1β的释放。PG1 的“线性化”不能抑制TNE-α或IL-1β的释放从而显著降低了其对脑膜炎球菌脂寡糖（LOS）和脑膜炎球菌多糖（CPS）的免疫调节活性[37,40]。除了先天免疫细胞，PG1 通过受体MRGX2 或FPRL1 还可激活肥大细胞，使其脱粒并抑制细菌生长，因此PG1 不仅具有抗菌潜力，还通过激活肥大细胞进行免疫调节，且通过肥大细胞协调适应性免疫在伤口愈合中起重要作用[38]。

3.4 细胞毒性 PG1 对不同类型哺乳动物细胞产生的细胞毒性不一样，细胞膜表面的阴离子电荷大小和PG1 与细胞相互作用时发生的构象变化都会影响细胞毒性水平。抑制细胞表面阴离子硫酸化蛋白多糖的合成可以减少PG1 引起的细胞毒性损伤[41]。PG1 对视网膜神经元细胞和中性粒细胞的影响最大，PG1 还会对人成纤维细胞有毒性，并引起红细胞明显溶解[41]。但利用计算方法评估PG1-5，基于Toxinpred 网站SVM 方法测评显示PG1无毒性，且PG1 在膜互作位点有芳香族氨基酸残基因而有较好的细菌膜通透性[5]，此外，PG1 氨基酸残基ARG（1）-GLY（17）中存在额外的键，其在二级结构中表现出更好的稳定性[5]。有研究表明，用组氨酸残基取代赖氨酸残基可以降低含组氨酸肽的细胞毒性，并且保持大多数多肽的抗菌活性[42]。因此，可以在PG1 的序列基础上进行改造，研制出有治疗价值的小分子多肽。

4 PG1 的应用研究

4.1 开发新型抗菌、抗病毒药物及应用 有研究者采用“分子拼接”的设计方法，运用生物信息学分析及圆二色谱法分析，杂合设计得到2 个具有β折叠结构的改良抗菌肽LB-PG 和CA-PG，杂合的改良肽通过与细胞膜作用和结合胞内DNA 共同作用发挥作用机制，能较好地保持PG1 的抗菌活性并扩大其抗菌谱，同时显著降低其对细胞的毒性，杂合肽的设计为研究新型抗菌肽提供了新的思路和方法[43]。PG1 作为5 种PG 的支架材料在稳定性和无毒性方面具有优势，可以作为未来设计治疗性PG 类似物的潜在支架[5]。而特定序列的PG1 抗菌肽衍生物能够特异性杀灭各种口腔致病菌，可预防和治疗口腔疾病，治疗效果更佳，并且制备的制剂具有稳定性强的特点，有良好的应用前景[44]。此外，口服重组PG1 可以减轻葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎引起的体重显著下降，将来开发重组PG1 的口服制剂治疗肠道损伤和炎症有很好的前景[45]。

联合使用抗菌药物，特别是具有不同靶点的抗菌药物，是克服多重耐药性的已知策略[46]，联合应用可以减少剂量及副作用。有研究者认为，个体抗菌剂在体内的高效性可能是生物体内抗菌肽的协同作用引起的[47]。有报道称抗菌药物在牡蛎、大黄蜂、甲虫等群体中有协同效应[48]。PG1 分别与人LL-37、牛bactenecin 和indolicidin 联用，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、粪肠球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的协同作用效果显著[49]。Morroni 等[50]检测PG1 对手术伤口感染鲍曼杆菌的抗菌和抗生物膜活性，结果发现PG1 和大肠杆菌素能协同对抗大肠杆菌素耐药菌株。PG1 与丁胺卡那霉素、四环素及多黏菌素B 等联用具有不同程度的协同效应，表现出联合抗菌作用，但并非与所有抗生素之间都存在协同关系，PG1 与先锋VI、左氟沙星及诺氟沙星之间则表现为不相关。抗菌肽与抗生素之间的相互关系及具体机制尚未明确[8,51]。

4.2 在动物转基因工程中的应用 目前抗菌肽应用广泛，但天然资源有限，人工化学合成价格昂贵，随着基因工程的发展，将PG1基因导入动物体内，提高动物的抗病力，是一种较为经济的方法。有研究表明，PG1在小鼠体内的转基因表达增强了小鼠对实验性细菌感染的抵抗力，为在中性粒细胞以外的其他体细胞组织中表达PG1 的转基因猪提供了理论依据[52]。异位表达PG1的转基因小鼠对猪放线杆菌感染的敏感性较同窝的野生型小鼠更高，且转基因小鼠存活率更高，所以PG1 在小鼠体内的异位表达能增强其对细菌感染的抵抗力[52]。

在基因工程方面最常用的是利用大肠杆菌工程菌表达外源蛋白。在大肠杆菌中转入PG1 的成熟肽基因，构建可表达融合蛋白的GST-PG1 基因工程菌，该重组菌具有显著的抗菌效果[53]。还可将编码成熟PG1 的DNA 序列与6His 标签融合，克隆到pPICZα-A 载体中，再转入到毕赤酵母中，表达的PG1/6His 对HepG2 细胞具有强烈的剂量和时间依赖性、抗癌活性[54]。这些研究为开发抗菌肽PG1 制剂提供了基础材料。

4.3 在免疫调节中的潜在应用研究 PG1 的抗菌特性已经得到了很好证实，但是其在免疫调节中的作用研究还有待完善。有研究者探索PG1 在免疫调节中的替代作用和潜在机制，实验发现成熟PG1 促进肠细胞迁移的过程，与PG1 对细胞迁移相关基因的表达改变有关，还促进了免疫相关因子和促炎细胞因子的表达[45]。进一步的研究表明，成熟PG1 能刺激IGF1R，并通过该受体调节免疫活性和细胞迁移，因此PG1 可能对胃肠道炎症有一定治疗潜力，同时推测PG1 在免疫调节中的应用也有一定可突破性。

5 小结和展望

基于近年来抗生素在养殖及药物产业限制使用，研究健康、无害、高效、绿色饲料添加剂产品成为当前畜牧兽医行业的热点。抗菌肽PG1 具有有效的抗病原微生物活性、免疫调节作用，能提高动物对疾病的抵抗能力，促进动物生长性能，且不易使动物产生耐受性，此外PG1 能通过基因工程大量表达，在体内有较好的稳定性。目前，抗菌肽PG1 及其结构类似物的作用机制也得到了深入研究，为开发出稳定性更好、活性更强、毒性更低的抗菌肽药物奠定了基础，PG1 及其类似物的开发将在动物养殖及治疗行业中具有重要的潜力和意义。