威宁鸡GnRH1、GnRH2 基因SNPs 鉴定及其与蛋品质性状的关联研究

欧茂均，王天松，张 勇，张习本*，郭徵力，曾姗姗，李未博，陈泽林，叶红英，张林达

（1.毕节市畜牧兽医科学研究所，贵州毕节 551700；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州大学动物科学学院，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025）

促性腺激素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH）是脊椎动物下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）的关键信号分子，是一种保守的神经肽。GnRH 通过刺激促性腺激素释放激素脑垂体前叶激素释放激素的释放来维持生殖功能，同时还以自分泌和旁分泌的方式作用于垂体外组织，在脊椎动物性腺的发育和生殖功能维持中起着重要作用。哺乳动物GnRH在20 世纪70 年代首次从猪和绵羊中鉴定出来，具有刺激垂体性腺细胞释放促黄体素（Luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）的作用[1-3]。GnRH在脊椎动物中具有多种亚型，即GnRH1、GnRH2和GnRH3，而GnRH3基因很可能已在四足动物基因库中丢失[4]。GnRH1 是由下丘脑神经元产生的一种十肽，以脉动的方式分泌到垂体门脉毛细血管，到达垂体前叶。GnRH1基因在鼠和人中进化上保守的调控元件包括3 个增强子和近端启动子，研究表明诱导GnRH1启动子的活性对GnRH神经元成熟过程中激活或抑制GnRH1的转录起关键作用[5]。GnRH2 是一种7 跨膜G 蛋白偶联受体，与αQ/11 相互作用介导细胞信号。研究发现GnRH2可通过增加A 型精子数量来促进原始精子细胞发生精原细胞、精子和睾酮释放[6-7]。目前许多学者利用组织定位以及RT-PCR、qPCR 等手段初步断定GnRH具有神经调节、控制繁殖行为和影响感观系统等功能，并在组织中广泛表达[8-11]。GnRH1、GnRH2已被证明可以影响动物的卵巢发育、睾丸等生殖器官的功能[12-13]，目前GnRH1、GnRH2基因功能研究报道在鱼类上较多，在家禽上研究很少，其SNPs 对鸡的产蛋性状是否有影响需进行深入研究。鉴于GnRH1、GnRH2基因在家禽性腺轴上的关键作用，本实验以威宁鸡为研究对象，采用直接测序技术筛选其SNPs 位点，探究威宁鸡GnRH1、GnRH2基因SNPs 与蛋品质的相关性，旨在为进一步研究GnRH1、GnRH2调控禽类生殖发育和繁殖的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品采集 实验选取300 日龄、体重相近（1 954±282 g）、健康的威宁鸡母鸡200 只于翅下静脉采集血样及对应鸡蛋，样品均采自贵州纳雍源生牧业股份有限公司。

1.1.2 主要试剂及仪器 DNA 提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）、DM2000-Marker、2×Taq Master Mixture（北京擎科生物科技有限公司）。紫外分光光度计（NanoDrop 2000），购自美国Thermo 公司。蛋壳强度测定仪（型号为EFR-01）购自北京天翔飞域仪器设备有限公司；凝胶成像仪（BioSens SC 710）购自上海山富科技仪器有限公司；PCR 仪（BIO-RAD C1000 TouchTM Thermal Cy-cler）购自美国BIO-RAD公司；蛋品质分析仪（型号为EA-01）购自北京天翔飞域仪器设备有限公司；电泳仪（PowerPacTM HV Power Supply）。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA 提取与引物设计 200 只鸡血液DNA 用Ezup 柱式动物基因组DNA 提取试剂盒提取，测定DNA 浓度后用1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。根据GenBank 上提供的鸡GnRH1、GnRH2基因序列（登录号：NC_006109.5、NC_006091.5），用Primer 3 Input 在线设计软件分别设计GnRH1、GnRH2基因部分外显子及内含子引物，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 GnRH1、GnRH2 基因引物序列

1.2.2 PCR 扩增及扩增产物测序 PCR 扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共35 个循环；72℃终延伸7 min。30 μL PCR扩增体系：DNA 模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，15 μL 2×Es Taq Master Mix，12 μL RNase-Free Water。PCR 扩增产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳进行检测合格后，挑选特异性好的PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 蛋品质检测 蛋重（g）：蛋品质分析仪进行称重。

蛋形指数：用游标卡尺测量鸡蛋的长胫和短胫，长胫和短胫之比即为蛋形指数。

蛋壳厚度（mm）：去除蛋壳内膜，用游标卡尺测量蛋壳钝端、中端、锐端的蛋壳厚度，求平均值。

蛋白高度（mm）：测量蛋黄边缘与浓蛋白边缘中点的浓蛋白高度，测量成正三角形的三个点，取均值。

蛋壳强度（Pa）：将蛋垂直放在蛋壳强度测定仪上，钝端向上，测定蛋壳表面单位面积上承受的压力。

哈氏单位：根据蛋重和蛋白高度，由公式HU=100log（H-1.7M0.37+7.60）计算哈氏单位，其中HU 表示哈氏单位，M 表示蛋重（g），H 表示蛋白高度（mm）。

蛋黄重（g）：将蛋清和蛋黄分离，滤纸吸干蛋黄表面的蛋清并去除系带等其他物质，用分析天平称取蛋黄重。

1.3 统计分析 用Megalign、BioEdit 和Seqman 等生物软件对序列进行比对拼接、确定SNPs 位点，并计算等位基因频率、基因型频率、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（He）、Hard-weiberg 平衡（χ2）和多态信息含量（PIC）。用Microsoft Excel 2010 进行数据初处理，SPSS 22.0 中一般线性模型对基因型与蛋品质指标进行关联性分析，模型为Y=μ+G+e，其中，Y 为性状观测值，μ 为群体均值；G 为基因型效应或双倍型效应，e 为随机残差。

2 结果与分析

2.1GnRH1、GnRH2基因的PCR 扩增 威宁鸡基因组DNA 的OD 值（OD260/280）经检测在1.8～1.9，表明DNA 纯度高。PCR 扩增结果如图1 所示，目的片段条带单一明亮，且PCR 扩增产物与预设片段大小相符，扩增产物可用于下一步的实验研究。

图1 GnRH1、GnRH2 基因PCR 扩增产物检测

2.2GnRH1、GnRH2基因SNPs 鉴定 由图2 可知，在威宁鸡GnRH1基因上未发现SNPs 位点，GnRH2基因发现6 个SNPs 位点，分别为位于外显子1 的g.11 G＞C，产生GG、GC 和CC 3 种基因型，属于错义突变，精氨酸变为脯氨酸；内含子1 的g.237 T＞C，产生TT、TC 和CC 3 种基因型；内含子1 的g.259 T＞C，产生TT、TC 和CC 3 种基因型；内含子2 的g.1191 A＞G，产生AA、AG 和GG 3 种基因型；内含子4 的g.3535 G＞T，产生GG、GT 和TT 3 种基因型；外显子6 的g.4090 T＞C，产生TT、TC 和CC 3 种基因型，导致苯丙氨酸变为丝氨酸，为错义突变。

图2 GnRH2 基因测序峰图及SNPS 位点

2.3GnRH2基因SNPs 遗传特性 由表4 可知，威宁鸡GnRH2基因g.11 G＞C 突变位点中优势基因型和优势等位基因分别为GG，G；g.237 T＞C 突变位点中优势基因型和优势等位基因分别为CC，C；g.259 T＞C 突变位点中优势基因型和优势等位基因分别为TT，T；g.1191 A＞G 突变位点中优势基因型和优势等位基因分别为GG，G；g.3535 G＞T 突变位点中优势基因型和优势等位基因分别为GG，G；g.4090 T＞C 突变位点中优势基因型和优势等位基因分别为CC，C。6 个突变位点中g.4090 T＞C 位点为低度多态（PIC＜0.25），其余均为中度多态（0.25＜PIC＜0.5）。SNPS 位点Hard-weiberg平衡结果表明：g.11 G＞C、g.237 T＞C、g.259 T＞C、g.4090 T＞C 位点未偏离Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），g.1191 A＞G 和g.3535 G＞T 位点偏离Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)。

表4 GnRH2 基因SNPs 群体遗传分析

2.4GnRH2基因SNPs 位点与威宁鸡蛋品质的关联性分析 由表5 可知，g.259 T＞C 位点对威宁鸡的蛋壳厚度影响达到显著水平，TT 基因型有利于改善蛋壳厚度。g.1191 A＞G 位点对威宁鸡的蛋壳强度影响达到显著水平，AG 基因型有利于改善蛋壳强度。g.11 G＞C、g.237 T＞C、g.3535 G＞T 和g.4090 T＞C 4 个SNPS 位点及相应基因型间对威宁鸡蛋品质的7个指标均未达到显著水平。

表5 GnRH2 基因SNPS 位点与蛋品质的关联性分析

3 讨 论

GnRH 在动物生殖过程中起着重要的调节作用，它由下丘脑神经元合成，从神经末梢释放到门脉循环，它与垂体前叶促性腺激素细胞GnRH1型受体结合后，刺激LH 和FSH 的合成和释放，这2 种多肽通过血液循环进入性腺，刺激性激素的合成和分泌，并触发配子发生。GnRH1、GnRH2作为卵巢内调节因子，可介导LH与LHR受体的结合，从而影响鸡卵泡发育和排卵，同时鸡性成熟的启动得益于接近开产时GnRH1mRNA的高表达[14-15]。鉴于鸡GnRH1、GnRH2基因在排卵和产卵中起关键作用，本研究通过直接测序法检测威宁鸡GnRH1、GnRH2基因的多态性，并评估这2 个基因的多态性对威宁鸡蛋品质性状的影响。

本研究在威宁鸡GnRH1基因上未鉴定出SNPs 位点，这与张莹等[16]在拉萨白鸡群体中研究GnRH-1基因多态性的结果相同，而拉萨白鸡GnRH-1基因经酶切反应后发现GG 型均为与开产日龄相关的有利基因型。王娜[17]研究表明GnRH1基因和GnRHR基因也可能与GnRH-依赖性性早熟相关，但在人上尚未发现这2 个基因的突变位点。从各种脊椎动物物种中克隆出编码GnRH的cDNA 和基因的相关研究，揭示了在所有形式的脊椎动物中GnRH整体结构的保守性，同时GnRH1十肽的结构在哺乳动物的谱系中几乎完全保守，在非哺乳动物脊椎动物中GnRH1十肽的氨基酸序列在物种间有很大差异[18]。综上，威宁鸡GnRH1基因无SNPs 位点，与GnRH结构的保守性、GnRH1十肽的氨基酸序列在物种间的差异是否有关，有待进一步研究探析。

威宁鸡GnRH2基因发现6 个SNPs 位点，多态信息含量分析发现，6 个突变位点中g.4090 T＞C 位点为低度多态，其余均为中度多态，说明这6 个位点的遗传变异较大[19]，在威宁鸡的遗传改良中能获得更多的遗传进展，在后续的选种选育中可作为威宁鸡繁殖力的遗传标记[20-21]。χ2结果显示g.1191 A＞G 和g.3535 G＞T 位点偏离了Hardy-Weinberg 平衡，说明这2 个位点可能与遗传漂变、环境、人工选择和育种措施等原因有关[22]。Bhattacharya 等[23]研究了白来航鸡的GnRH1和GnRH2基因编码区多态性，发现GnRH1和GnRH2基因的CDS 区是多态的，GnRH1的单倍型对64 周龄产蛋体重、产蛋量、蛋黄含量、哈式单位和蛋壳参数有显著影响，GnRH2的单倍型显著影响白来航鸡的性成熟年龄。威宁鸡GnRH2基因g.259 T＞C 位点、g.1191 A＞G 位点对威宁鸡的蛋壳厚度和蛋壳强度影响达到显著水平，TT基因型有利于改善蛋壳厚度，AG 基因型有利于改善蛋壳强度，表明GnRH2基因的单核苷酸多态性与威宁鸡的蛋品质性状密切相关，但是否影响威宁鸡的性成熟年龄还需进一步研究验证，同时推测这2 个位点是威宁鸡蛋品质性状的关键位点，可作为威宁鸡蛋品质性状中蛋壳厚度、蛋壳强度的分子标记。分子标记可为后续威宁鸡高产蛋鸡新品系、配套系等培育提供支持，保种效果的评估也可利用这些多态位点。

4 结 论

本实验结果显示，威宁鸡GnRH1基因并未发现SNPs 位点。GnRH2基因发现6 个SNPs 位点，均产生3 种基因型，分别位于外显子1 的g.11 G＞C，属于错义突变，精氨酸变为脯氨酸；内含子1 的g.237 T＞C；内含子1 的g.259 T＞C；内含子2 的g.1191 A＞G；内含子4 的g.3535 G＞T；外显子6 的g.4090 T＞C，导致苯丙氨酸变为丝氨酸，为错义突变。GnRH2基因g.259 T＞C位点显著影响威宁鸡蛋壳厚度，g.1191 A＞G 位点显著影响威宁鸡蛋壳强度。因此，GnRH2基因g.259 T＞C位点和g.1191 A＞G 位点有望作为威宁鸡蛋品质性状相关的关键位点和分子标记。