盐胁迫对醉马草和高羊茅种子萌发及幼苗生长的影响

陈雅琦，苏楷淇，李春杰

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室/ 兰州大学农业部草牧业创新重点实验室/ 兰州大学草地农业教育部工程研究中心/兰州大学甘肃省西部草业技术创新中心 / 兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020）

盐渍化土地是有限土地可利用资源的重要组成部分。全球约有10亿hm2土地受到盐渍化的侵袭，且以每年100万～150万hm2的速度快速增加[1]。中国是遭受土壤盐渍化危害最为严重的国家之一，盐渍化土地面积达3.6×107hm2，占全国可利用土地面积的4.88%[2]，且大多分布在甘肃、新疆等西北干旱地区。中重度土壤盐渍化(土壤含盐量>0.3%)会显著抑制植物的生长发育[3-4]，因此，土壤盐渍化是制约西北旱区农业及生态恢复的重要因素之一。

草坪草作为城市绿化的重要组成部分，具有改善和美化城镇居住环境的积极作用。其种植水平是衡量当地绿化效果的重要标准。草坪草具有一系列独特的功能，生物学特征和栽培管理技术，与牧草等农作物之间既有特殊性又有其营养共性，故发展耐盐草种可为发掘及栽培耐盐牧草等作物提供参考依据[5]。选育及栽培耐盐草坪草种可充分利用有限土地资源，对西北地区农牧业发展、生境恢复及美化环境具有十分重要的意义。故发掘及种植耐盐草坪草种已成为亟待解决的问题。

高羊茅(Festuca arundinacea)为冷季型草坪草，属禾本科羊茅属多年生上繁禾草，耐践踏、耐干旱、成坪常绿优美且能适应大多数土壤类型，便于管理[6-8]，常作为先锋草坪草种使用。醉马草(Achnatherum inebrians)为冷季型禾草，属禾本科芨芨草属多年生上繁禾草，常见于西北高海拔地区[9]，于1994年发现其种子并检测到携带内生真菌且携菌率接近100%[10-11]，在国际上与美国苇状羊茅–内生真菌、新西兰多年生黑麦草–内生真菌并称为三大禾草内生真菌[11]。一方面，内生真菌与醉马草互为共生体，互惠互利。研究表明，醉马草–内生真菌共生体具有抗生物胁迫[12-13]、抗寒[14]、抗旱[15]、抗金属[16]、耐盐碱[17-18]，生长快、竞争力强[19]等优良草坪草种特性。另一方面，醉马草–内生真菌体内产生的有毒生物碱使其成坪其间免受啃食[20-22]。近年来醉马草因其优良特性被作为新型草坪草种广受关注。

在盐渍土壤环境下，多年生禾草建植草坪的关键在于处在盐浓度较高土壤表层的种子的发芽能力以及幼苗期间的生存能力。有关盐胁迫对冷季型草坪草的种子萌发和幼苗生长的研究较多，但以成熟草坪草种作为对照，来研究醉马草作为新型草坪草种潜力的研究却鲜见报道。醉马草与高羊茅同属多年生上繁禾草，具有一定相似性，且高羊茅是应用最为广泛的草坪草之一，故与高羊茅作为对照，可论证醉马草作为新型草坪草种的发展潜力。因此以带菌醉马草、不带菌醉马草、高羊茅‘侠客岛’、高羊茅‘猎狗6号’作为试验对象，研究不同盐胁迫对两种禾草种子萌发特性和幼苗特性的影响并对其耐盐性进行综合评价，为西北盐渍地区冷季型草坪草的选育、建植和管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为西北地区常见禾草，共2属4份种质。分别为带菌醉马草，不带菌醉马草，高羊茅‘侠客岛’和高羊茅‘猎狗6号’，高羊茅种子由甘肃红瑞园林绿化工程有限公司提供。试验所用醉马草种子于2019年8月采自甘肃省夏河县(102°33′E，35°11′N)，镜检发现其带菌率100%，将一半醉马草种子用稀释100倍的70%甲基托布津浸泡2 h灭菌，灭菌后再次镜检，确认带菌率为0，得到不带菌的醉马草种子。将确认后带菌(A1)/不带菌(A2)的醉马草种子和‘侠客岛’(A3)、‘猎狗6号’(A4)种子分别在5℃下密封保存，试验前采用物理方法打破种子休眠以供后续试验使用[23]。

将覆盖两层滤纸、直径为12 cm的培养皿进行2 h的150℃高温消毒，避免种子在试验过程中受到污染。

1.2 试验方法

1.2.1 种子发芽试验

种子发芽试验于2020年6月采用双层滤纸培养法进行。选取颗粒饱满、大小均一且无病害的4个品种禾草种子，用蒸馏水浸泡24 h后晾干。用质量分数分别为0.1%(C1)、0.3%(C2)、0.5%(C3)、0.7%(C4)、0.9%(C5)的NaCl溶液作为盐胁迫处理液，蒸馏水作为对照(CK)。在培养皿中平铺两层滤纸，4份种质分别放置其中，每皿50粒，然后加入对应浓度10 mL的盐溶液处理，每个处理3个重复，共72个培养皿。每隔2 d加入相同的水分，以保证各盐胁迫处理液浓度保持不变。将培养皿置于25℃、光暗周期为12 h的恒温培养箱内。每日观察记录种子萌发及幼苗生长状况。培养皿内发芽温度为25℃、每日光照时数为12 h。

1.3 指标测定

以芽身超过本身长度的1/2或超过根长作为种子发芽的标志，每隔24 h观察记录一次发芽状况。各种子萌发截止时间不同(连续3 d无种子发芽即为萌发停止)，带菌醉马草(A1)第15天结束，不带菌醉马草(A2)第15天结束，侠客岛(A3)第13天结束，猎狗6号(A4)第14天结束。种子发芽试验结束后进行相关指标的计算与评估。计算公式如下：

种子发芽指标：

发芽率= (末期发芽数/供试种子数)×100%；

相对发芽率=(处理组发芽率/对照组发芽率)×100%；

发芽势=(发芽高峰时种子的发芽总数/供试种子数)×100%；

相对发芽势=(各个处理的发芽势/对照组的发芽势)×100%；

式中：Gi为不同培养时间(t) 的发芽种子数，Dt为相应的培养时间，S为幼苗高度。

幼苗生长及根系指标：发芽试验结束后，每个处理随机取10粒种子，分别测其幼苗高度(S)、胚根长(RL)，不足10株的全部测量，取其平均值。

相对胚根长= 处理组平均胚根长/对照组胚根长；

根冠比= 平均胚根长/平均苗高。

耐盐性评价指标：

1)种子萌发阶段。分别以A1、A2、A3、A4这4种禾草种子的相对发芽率为因变量(y)，以盐浓度为自变量(x)建立函数方程，以相对发芽率下降至75%、50%、10%时所对应的NaCl溶液浓度作为4份种质的耐盐适宜浓度、耐盐半致死浓度及耐盐极限浓度。

2)幼苗生长阶段：分别以A1、A2、A3、A4的相对胚根长为因变量(y)，以盐浓度为为自变量(x)建立函数方程，以相对胚根长下降50%时所对应的NaCl溶液浓度作为4份种质幼苗的耐盐阈值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010统计数据并制图，采用SPSS 20.0软件进行发芽率、发芽势等种子发芽指标数据的方差分析，并通过Duncan’s新复极差法进行多重比较。将4份种质的相对发芽率和相对胚根长度与盐浓度进行最优曲线估计与曲线回归分析，从而对4份种质的萌发期和幼苗期的耐盐性分别进行综合评价。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对醉马草和高羊茅种子发芽率和发芽势的影响

4份种质材料的种子发芽率随盐浓度的升高呈下降趋势，其中A1在0.1%(C1)、0.3%(C2)、0.5%(C3)盐浓度下，A2在0.1%(C1)、0.3%(C2)盐浓度下的发芽率略高于对照组，说明轻中度的盐分胁迫对A1和A2的种子萌发无显著影响(P>0.05)(表1)。A1和A2在浓度为0.5%时的发芽率仍能维持在65%以上，浓度为0.7%时发芽率才显著降低(P<0.05)。两者发芽率在任一盐浓度下均无显著差异。A3在盐浓度为0.5%时发芽率显著下降，达到0.7%时停止发芽。A4在盐浓度为0.7%时发芽率显著降低。在大于0.5%的盐分胁迫下，A3与A4的发芽率显著低于A1、A2。除A1和A2的0.3%以及A3、A4的0.5%盐浓度外，4份种质的种子发芽势均低于对照组且随盐浓度的升高呈下降趋势，其中A1、A2、A4的发芽势在0.7%的盐胁迫下显著降低，A3在浓度为0.5%时，发芽势显著降低且在0.7%时不再发芽。盐浓度大于0.5%时，A1发芽势显著高于A3但与A2、A4差异不显著。综上可知，0.7%及以上的NaCl盐分胁迫可显著抑制种子萌发，使其发芽率和发芽势显著降低。与对照相比，受到0.7% NaCl胁迫的A1、A2、A3、A4的发芽率分别下降34.38%、56.16%、100%和68.06%，发芽势分别下降55.32%、70.69%、100%和84.85%；受到0.9% NaCl胁迫的A1、A2、A3、A4的发芽率分别下降35.94%、54.79%、100%和73.61%，发芽势分别下降57.45%、81.03%、100%和81.80%。

表1 盐胁迫对种子发芽率和发芽势的影响Table 1 Effect of salt stresson seed germination rateand energy

2.2 盐胁迫对醉马草和高羊茅种子发芽指数、活力指数的影响

4份种质材料的种子发芽指数和活力指数均随盐浓度的升高呈下降趋势，其中A1、A2在0.1%、0.3%盐浓度下的发芽指数与活力指数略高于对照组，A3在0.3%盐浓度下的发芽指数高于对照组且无显著差异(P>0.05)(表2)。说明中轻度的盐分胁迫对以上3种种子的萌发无显著影响。除0.1%和0.3%盐胁迫外，A1、A2的发芽指数与活力指数无显著差异。除对照外，在任一盐浓度下，A1、A2、A4的发芽指数和活力指数均显著优于A3(P<0.05)。由此可知，盐分胁迫对于A3种子萌发的抑制尤为强烈。与对照相比，A1在盐浓度为0.7%和0.9%时发芽指数显著降低，较对照分别下降48.27%、52.80%，在盐浓度为0.5%及以上时，其活力指数显著下降，下降幅度分别为20.56%、78.48%、78.62%。A2在盐浓度为0.7%和0.9%时发芽指数与活力指数显著降低，分别下降66.60%、72.41%和73.58%、90.06%。A3在盐浓度为0.5%及以上时发芽指数和活力指数显著降低，分别降低了69.19%和84.46%，且在浓度达到0.7%时两指标骤降至0，表明高浓度盐分胁迫已使A3停止萌发。A4在盐浓度为0.5%及以上时发芽指数显著降低，分别下降38.87%、85.95%、87.41%，其活力指数在轻中度盐胁迫(0.3%和0.5% NaCl)时已显著降低，下降幅度为28.79%和66.98%，并在重度胁迫(0.7%和0.9% NaCl)时骤降95.54%与95.72%。综上可知，0.7%及以上的重度盐胁迫可显著抑制A1、A2的种子萌发，0.5%及以上的重度盐胁迫抑制可显著抑制A3、A4的萌发。A3的种子萌发状况显著弱于其余种质。

表2 盐胁迫对种子发芽指数和活力指数的影响Table 2 Effect of salt stresson seed germination and vigor indexes

2.3 盐胁迫对醉马草和高羊茅幼苗生长的影响

在0.1%、0.3%轻度盐胁迫下的苗高略高于对照组且无显著差异(P>0.05)(表3)，A4在0.1%的盐浓度下同样如此。说明轻度盐胁迫对以上两种种质幼苗高度的变化无显著影响。A2在0.1%、0.3%盐浓度下的幼苗高度显著高于对照组(P<0.05)，与对照组比，分别提高了25%、28.76%。表明轻度盐胁迫对于A2幼苗的生长有一定的促进作用。与对照相比，A1在盐浓度为0.5%及以上时苗高显著降低，分别下降14.09%、57.94%、53.24%。A2在0.7%、0.9%时苗高显著下降，分别下降45.53%、72.63%。A3在0.5%及以上的中高度盐胁迫时苗高显著降低，下降幅度为58.71%，并在0.7%时骤降至0。表明0.7%及以上的重度盐胁迫可使A3幼苗停止生长。A4在0.3%盐浓度时苗高出现显著降低，较对照组分别下降12.32%、48.12%、69.39%和79.63%。综上可知，0.5%及以上的中高度盐胁迫可显著抑制A1、A3两种禾草的幼苗生长，盐浓度为0.3%时的轻度胁迫就可显著抑制A4的幼苗生长。0.7%及以上的重度盐胁迫才可显著抑制A2的幼苗生长。

从胚根长度变化来看(表3)，4份种质的胚根长均低于对照组且随盐浓度的升高呈下降趋势。与对照相比，A1和A4在盐浓度为0.7%及以上时胚根长显著降低(P<0.05)，分别降低了31.56%和36%、37.85%和60.73%。A2仅在盐浓度为0.9%时胚根长才显著降低，降低了58.92%。而A3的胚根长在任一盐胁迫下均较对照显著降低。说明0.7%及以上的重度盐胁迫可显著抑制A1、A4的胚根生长。0.9%的重度盐胁迫才可显著抑制A2的胚根生长，而任一盐分胁迫都可显著抑制A3幼苗胚根生长。

从根冠比来看(表3)，随着盐浓度的升高，4份种质的幼苗根冠比均基本呈上升趋势。其中A2、A3在盐浓度为0.1%、0.3%时根冠比略低于对照组但无显著差异(P>0.05)，A4在盐浓度为0.1%时同样如此。说明轻度盐胁迫对A2、A3、A43份种质的根冠比无显著影响。与对照相比，A1在盐浓度为0.7%及以上时根冠比显著提高(P<0.05)，分别提高了58.33%和50.00%。A2仅在盐浓度为0.9%时根冠比显著提高，提升幅度为49.52%。A3在盐浓度为0.5%时根冠比显著提高，提升36.49%。A4则在盐浓度为0.5%及以上时根冠比显著提高，分别提高31.58%、52.08%、48.31%。综上可知，盐浓度为0.5%及以上的中重度盐胁迫对幼苗高度的影响显著高于对胚根生长的影响。

2.4 醉马草和高羊茅综合耐盐性评价

将4份种质的相对发芽率和相对胚根长度与盐浓度进行最优曲线估计与曲线回归分析(表4)，结果表明， A1、A2、A3、A4的相对发芽率与盐浓度之间均呈现良好的三次曲线函数关系且拟合程度最优。A1和A3的相对胚根长与盐浓度浓度呈良好的三次曲线函数关系时拟合程度最优。A2和A4则与盐浓度呈现出良好的二次曲线函数关系时拟合程度最优。由建立的最优函数方程可知(表4、表5)，在种子萌发阶段(相对发芽率)，A1、A2、A3、A4的耐盐适宜浓度分别是0.70%、0.60%、0.37%和0.49%。耐盐半致死浓度分别为0.98%、0.72%、0.46%和0.61%。耐盐极限浓度分别为1.02%、0.91%、0.61%和0.87%，从大到小依次为A1>A2>A4>A3。幼苗阶段(相对胚根长)的A1、A2、A3、A4的耐盐阈值分别为1.23%、1.01%、0.44%和1.09%，从大到小依次为A1>A4>A2> A3。

表3 盐胁迫对4份种质幼苗生长的影响Table 3 Effect of salt stresson seedling growth of four germplasms

表4 盐胁迫下4份种质的相对发芽率与盐浓度的回归分析Table 4 Regression analysis of relative radicle length and salt concentration of four germplasms

表5 盐胁迫下4份种质的相对胚根长与盐浓度的回归分析Table 5 Regression analysis of relative germination rate and salt concentration of four germplasms

综上可知，无论是在种子萌发阶段还是幼苗生长阶段，A1耐盐性均为最优，A3均为最差。种子萌发阶段A2耐盐性优于A4，幼苗生长阶段的A4则优于A2。

3 讨论

3.1 盐胁迫对醉马草和高羊茅种子发芽的影响

植物的生长发育受到多种环境因素的影响，包括干旱、寒冷和盐碱胁迫等。种子萌发和幼苗生长状况是评估种质质量的重要指标，也是建植草坪的必要基础，但同时处在萌发阶段的种子也是极为脆弱的[24]。盐分逆境下的种子通常表现为生命力衰弱、胚芽、胚根等生长受抑，甚至停止萌发[25-26]。NaCl盐分胁迫对植物发芽的影响由两部分组成。一是，高盐环境下的Na+含量超高，对植物造成了单盐毒害。植物吸收过多Na+导致体内出现离子失衡。二是，植物体内的渗透势相对于盐溶液过高，使植物体内水分流失，造成植物脱水等不良反应[27]。

发芽率、发芽势、发芽指数等指标可反映出种子活力、出苗速度和整齐度等发芽特性。4份种质的种子发芽率和发芽势均随盐浓度的上升呈下降趋势，仅有带菌醉马草的发芽率和发芽势在轻度盐胁迫时呈上升趋势，这与陈新等[28]的研究结论相一致，推测这与不同品种间耐盐性及盐逆境响应差异有关。重度盐胁迫下，高羊茅‘侠客岛’的发芽率、发芽势等指标均为0，说明此时重度盐分胁迫已使‘侠客岛’停止萌发。相比之下，醉马草在NaCl盐分胁迫下的发芽率和发芽势等指标都较为稳定，且试验结果表明，轻度盐胁迫对醉马草种子的萌发具有一定的促进作用，推测是低浓度盐分促进了细胞的渗透调节，并刺激了抗氧活酶的活力[8,29]，从而对萌发产生了积极影响，此外，中重度盐分胁迫下的带菌醉马草，其发芽率等指标均高于不带菌醉马草。总体而言，带菌醉马草受盐分胁迫的影响较小，推测是由于带菌醉马草带有内生真菌Epichloë gansuensis，增强了宿主对逆境的抗性，使其免受盐分胁迫的危害。Bharadwaj等[30]证明，内生真菌的存在促使在盐分逆境中的植物提高叶绿素、脯氨酸等调节渗透物质的含量，降低丙二醛的含量，从而增强植物在盐分逆境中的生存能力。本研究显示了带菌醉马草在盐胁迫下的稳定发芽率和发芽势，且得出的结论与段春华等[18]的研究结果相一致。

种子发芽指数和活力指数是种子综合活力的体现，是衡量种子品质的重要标准。种子活力与生命力是逆境生存的保障。4份种质的发芽指数和活力指数与发芽率和发芽势的结论类似，再次证明了带菌醉马草的旺盛活力和对NaCl盐分胁迫的优良耐受性。对于种子来说，重度盐胁迫使其种子周围水势降低，使得种子内外水势差异增大，致使种子失水，细胞内大量溶质流失，并造成质壁分离等情况。而醉马草中的内生真菌可以通过增加脯氨酸或者可溶性糖等渗透物质，增加细胞内抗氧化酶的含量等一系列生理活动[31]，从而有效减轻NaCl盐分胁迫造成的渗透效应和离子失衡对于植物的伤害。

3.2 盐胁迫对醉马草和高羊茅种子幼苗生长的影响

胚根能否顺利突破种皮并扎根是幼苗生长的关键，处于该幼苗阶段的植物对盐分胁迫通常很敏感且更易受到伤害[32]。因此，利用种子萌发和幼苗生长的试验，可初步预见醉马草和高羊茅两种质在不同盐胁迫环境中发芽、建植和生长的情况，进而揭示植物在盐分逆境中的适应和改变规律。

本研究结果表明，重度盐胁迫对醉马草和高羊茅幼苗高度的影响大于根长。这可能是由于重度盐胁迫使幼苗细胞严重失水、质壁分离，进而对胞内抗氧化酶及激素的合成造成影响，致使幼苗生长受抑程度大于根长[33]。梁正伟等[34]对羊草(Leymus chinensis)、赵斌等[35]对洋金凤(Caesalpinia pulcherrima)等3种热带植物和Li等[36]对552份向日葵(Helianthus annuus)种质在盐胁迫下的种子萌发和幼苗生长的研究结论亦与本研究一致，推测是因植物根系是最早接触盐溶液的器官，对盐分胁迫的响应最早，为适应逆境而进行相应的生理反应所致。

3.3 耐盐性评价

本研究结果表明，盐分胁迫下的带菌醉马草种子发芽率、发芽势及发芽指数、活力指数等指标最优，种子活力最为旺盛，高羊茅‘侠客岛’最差。本研究通过建立最优函数方程预测出带菌醉马草的耐盐适宜浓度、耐盐半致死浓度、耐盐极限浓度分别为0.70%、0.98%和1.02%；不带菌醉马草的3种浓度分别为0.60%、0.72%和0.91%；高羊茅‘侠客岛’的3种浓度分别为0.37%、0.46%和0.62%；高羊茅‘猎狗6号’的3种浓度分别为0.49%、0.61%和0.87%；带菌醉马草、不带菌醉马草、高羊茅‘侠客岛’、高羊茅‘猎狗6号’幼苗生长阶段的耐盐阈值依次为1.23%、1.01%、0.44%和1.09%。由此可知，带菌醉马草的耐盐适宜浓度、耐盐半致死浓度、耐盐极限浓度、耐盐阈值均高于其余3个种质，明确了带菌醉马草种子萌发和幼苗生长阶段的NaCl耐受性依次为A1>A4>A2>A3。综上所述，带菌醉马草对于NaCl单盐胁迫具有相当的耐受性，作为西北盐碱地区的新型草坪草种具有优良发展潜力，可提高西北地区土壤资源利用率并缓解盐渍化带来的危害。

4 结论

本研究以醉马草和高羊茅种子作为研究对象，分析了不同单盐胁迫下对种子萌发和幼苗生长的影响，并对其综合耐盐性进行评估。结果表明：1)盐胁迫对4份种质的萌发及幼苗生长均有抑制作用。2)经评估，4份种质的综合耐盐性依次带菌醉马草>高羊茅‘猎狗6号’>不带菌醉马草>高羊茅‘侠客岛’。带菌醉马草耐盐性最佳，具有成为西北地区优良草坪草种的巨大潜力。