牦牛粪沉积对青藏高原高寒草甸土壤酶活性的影响
2021-06-18张志阳张世挺
张志阳,张世挺
(草地农业生态系统国家重点实验室/ 兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000)
放牧是草地生态系统主要的土地利用方式[1]。在放牧草场中,食草动物消耗的大部分初级生产力只有小部分被同化,大量的碳(C)和养分以动物粪便的形式返回草地[2]。例如,在新西兰一个奶牛牧场中[2],每年通过粪便返回草地的碳约32000 kg·hm−2,氮约1040 kg·hm−2。因此,牲畜粪便是放牧草地生态系统中土壤有机碳和养分的重要来源[3]。
粪便中的碳和养分可以通过有机质的淋溶和分解进入土壤[4-5]。有研究表明,在温带草原上,两个月内粪便中有10%~16%的C渗入土壤[6-7]。粪便中大部分氮以铵态氮的形式进入土壤[8],进而增加土壤中的氮含量[5]。此外,粪便也能通过影响土壤的其他理化性质,例如水分含量和pH,间接调节土壤元素循环[4,9-10]。
土壤酶在有机质分解和养分循环中起着关键作用[11]。研究表明酶活性直接受微生物生物量的控制[12-13]。此外,酶活性还受基质的可利用性、土壤水分含量和pH的影响[13-14]。牲畜粪便为土壤输入了大量的外源性可利用碳和养分,可能刺激土壤微生物的生长和酶的活性[15]。以往的研究表明,牛粪沉积能够改变土壤微生物生物量[3,5]和酶活性[16-17]。然而,关于牛粪沉积引起的非生物因素和生物因素如何调控土壤酶活性的研究相对较少[18-19]。
牦牛是青藏高原的主要畜种,大约有1330万头家养牦牛和2万头野生牦牛,通过放牧大量的粪便直接沉积在草地上[20-21]。因此,牦牛粪是该地区土壤碳和养分输入的主要来源。在该地区进行的许多研究表明牦牛粪的后续分解能够增加土壤肥力和牧草产量[22-24]。然而,很少有研究关注牦牛粪沉积对该地区土壤微生物群落及其功能的影响。因此,在本研究中,主要解决的问题是:1)牦牛粪分解如何影响土壤理化性质,微生物生物量和酶活性;2)牦牛粪沉积引起的土壤理化性质和微生物生物量的变化如何调控土壤酶活性。
1 材料与方法
1.1 研究地点
研究地点位于甘肃省合作市境内的兰州大学高寒草甸与湿地生态系统定位研究站(34°55′N,102°53′ E, 海拔2910 m)。试验期间日均温度为11.5℃,总降水量为326 mm。植被类型为亚高山草甸,主要优势物种为垂穗披碱草(Elymus nutans)和矮嵩草(Kobresia humilis)。研究区域放牧强度约每公顷3头牦牛。
1.2 牦牛粪收集
将新鲜的牦牛粪收集到桶中,并将其充分混合以确保均质性。添加的牦牛粪堆为直径20 cm,厚度4 cm,平均鲜重1.5 kg。
1.3 试验设计
在进行试验之前,用围栏围封了一个10 m ×20 m的样地,以防止试验期间牦牛放牧的干扰。该试验于2017年7月20日−10月10日进行。试验采用随机区组设计,每个区组内包括牦牛粪添加和土壤对照(以直径为20 cm的铁丝圈标记)两种处理,总共设置5个重复,相邻区组之间间隔2 m。每个区组内放置了4个粪堆和4个铁丝圈,牦牛粪和/或铁丝圈间隔2.5 m。整个试验期间总共进行4次采样。
1.4 采样
在粪便添加的21、40、60和83 d后分别进行采样。收集牛粪并采集牛粪下方和铁丝圈内的表层土壤(0–15 cm),将所有样品混合均匀后装入自封袋,置于4℃冰盒中带回实验室。在确定粪便鲜重后,将其分为两个子样品:一部分在105℃下烘干至恒重测定牦牛粪质量损失;另一部分储存在4℃冰箱内用于理化性质分析。将每个土壤样品过2 mm的筛子后同样分成两个子样品:一部分在荫庇处风干用于土壤理化分析;另一部分储存在4℃冰箱内,用于土壤可溶性碳和氮,微生物生物量和酶活性分析。
1.5 指标测定及方法
水分含量:将10 g新鲜样品(牦牛粪和土壤)均匀地铺在已知准确质量的铝盒中,将铝盒置于105℃的烘箱中烘干至恒重,根据样品前后质量差计算水分含量。
粪便质量剩余率=采样时的粪便干重/初始粪便干重×100%。
土壤pH:土壤pH采用电位法进行测定,即称取10 g过2 mm筛的风干土壤于25 mL去离子水中(土水比为1꞉2.5,W ꞉V),使用恒温振荡器摇动30 min,然后静置30 min,用配有甘汞电极的pH计测定上清液中的pH。
可溶性有机碳(DOC)和可溶性有机氮(DON)的测定:称取新鲜样品(土壤20 g,牦牛粪10 g)于盛有100 mL 0.5 mol·L−1K2SO4提取液的三角瓶中,将其在往复振荡器上震荡1 h,然后在10 000 r·min−1下离心10 min,上清液用0.45μm硝酸纤维素滤膜过滤[25]。使用TOC仪测定滤液中的DOC和总溶解性有机氮(TDN),流动注射分析仪测定滤液中的N和N。DON计算为TDN与无机N(NH4+和N)之差。
土壤微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)测定:使用氯仿熏蒸提取技术测定MBC和MBN含量[26],即称取新鲜的土壤20 g于培养皿中,将其置于盛有60 mL氯仿的真空干燥器中并抽至真空。另取等量的土壤置于另一真空干燥器中,但不熏蒸作为对照。将干燥器在避光条件下在25℃的恒温培养箱中培养24 h。将熏蒸和未熏蒸的土壤用80 mL 0.5 mol·L−1的K2SO4提取液提取,然后离心、过滤。使用TOC仪测定滤液中总有机碳和总氮。MBC和MBN的转换因子分别为0.45和0.54。
土壤酶活性测定:β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)活性采用可见风光光度法测定[27],以ρ-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,在25℃下培养2 h后在410 nm波长下测定催化生成的产物对硝基苯酚(PNP);β-1,4-木糖苷酶(BX)活性采用微孔板荧光法测定[28],以4-MUB-β-D木糖苷酶为底物,在25℃下培养4 h后在365 nm激发波长和450 nm发射波长下测定催化生成的产物4-MUB;脲酶(urease)活性采用靛酚蓝比色法测定[27],以4 mmol·L−1尿素用为底物,在25℃下培养24 h后,在578 nm波长下测定催化生成的产物N。
1.6 数据分析
在进行统计分析之前对所有数据进行正态性检验。采用重复测量方差分析(RMANOVA)确定牦牛粪添加对土壤水分含量、pH、可溶性有机碳和氮、微生物生物量和酶活性的影响。采用t检验确定各个变量在不同采样时间的显著性差异。采用冗余分析(RDA)解释酶活性与土壤理化性质和微生物生物量之间的关系。蒙特卡罗置换检验用于检验土壤理化性质、微生物生物量和酶活性之间的显著关系。所有的统计分析均在R语言(R Development Core Team, 2020, 4.0.0)软件中完成。RDA分析使用“vegan”软件包完成。
2 结果
2.1 牦牛粪质量损失及可溶性碳氮变化
经过83 d的分解后,牦牛粪分解了29.4%。DOC和DON的初始含量分别为16.22和3.25 g·kg−1。随着分解DOC和DON含量持续降低(图1)。
2.2 土壤理化性质
牛粪添加显著增加了SMC(P<0.01)(表1),与对照相比,第2次采样时显著增加(图2)。牛粪添加降低了土壤pH(P<0.001)(图2),采样时间及采样时间与牛粪添加的交互作用都不影响pH(表1)。与对照相比,牛粪添加显著增加了土壤DOC(P<0.001)和DON(P<0.001)含量,并且在第2次采样(牛粪添加40 d) 时达到了最大值,随后持续减小(图2)。采样时间及采样时间与牛粪添加的交互作用都显著影响了DOC和DON (表1)。
2.3 土壤微生物生物量和土壤酶活性
图1 试验期内牦牛粪质量剩余率和可溶性有机碳(DOC)和可溶性有机氮(DON)的平均值Figure 1 Mean valuesof yak dung mass remaining and dissolved organic carbon(DOC)and dissolved organic nitrogen(DON)during experiment period
表1 粪便添加和采样时间及其交互作用对土壤理化性质、微生物生物量和酶活性影响的方差分析(RMANOVA)Table 1 Repeated measures analysis of variance (RMANOVA)testing of the effects of dung deposition sampling time,and their interactions on soil physicochemical properties,microbial biomass,and enzyme activities,respectively
牛粪添加,采样时间及其交互作用均显著影响所有检测的微生物变量(P<0.05)(表1)。与对照相比,牛粪添加处理下MBC和MBN含量分别显著增加了14.24%(P<0.001)和20.29%(P<0.001),并且在第2次采样(牛粪添加40 d)增加的幅度最大(图3)。牛粪添加,采样时间及其交互作用也显著影响了BG(P<0.001),BX(P<0.001)和URE(P<0.001)的活性(表1)。与对照相比,牛粪添加显著增加了BG、BX和URE活性,增幅分别为8.4%、8.2%和6.6%,并且在第2次采样时增加的幅度最大(图3)。
2.4 土壤理化性质,微生物生物量和酶活性之间的关系
冗余分析(RDA)的结果表明(图4),土壤理化性质和土壤微生物生物量显著影响了土壤酶活性(F=31.03,P=0.001),这些因素总共解释了土壤酶活性84.18%的变异。RDA的第一轴和第二轴分别解释了酶活性变异的81.5%和2.5%。DOC,DON,MBC和MBN与土壤酶活性呈正相关关系(R2= 0.22,P< 0.001;R2= 0.26,P< 0.001;R2= 0.16,P< 0.001;R2=0.11,P< 0.001),pH与土壤酶活性呈负相关关系(R2=0.069,P<0.034)。SMC与土壤酶活性之间没有显著相关性(R2= 0.008,P= 0.23)。
3 讨论
3.1 牦牛粪质量损失及可溶性碳氮动态变化
图2 牦牛粪添加对土壤水分含量、p H、可溶性有机碳和可溶性有机氮的影响Figure 2 Effects of yak dung deposition on soil moisture content,p H ,dissolved organic carbon and dissolved organic nitrogen
本研究表明,在野外分解83 d后牦牛粪质量损失了29.4%,这与以前的研究结果一致[29]。Li等[30]的研究结果表明牦牛粪完全分解需要3年左右的时间。因此,本研究牦牛粪在一个生长季节的分解相对较少(29.4%)。另外,粪便的沉积季节会影响其分解。例如,由于秋季和冬季的温度较低,质量损失率会降低[21]。在整个研究过程中,牛粪中DOC和DON的含量随着分解而不断降低,这可能是由于降水将可溶性有机物质和矿质养分逐渐浸出到土壤中所致,特别是在分解的早期。此外,大型无脊椎动物如粪甲虫和蝇类是牦牛粪分解的两个主要功能群体[31],它们主要以新鲜的粪便液体和较小的粪便颗粒为食[32]。研究期间观察到,当牦牛粪置于草地不久后就有粪甲虫和蝇类定殖。在第1次采样时,由于牛粪水分含量的下降和“粪壳”的形成,蝇类已经完全消失,仅剩下粪甲虫。因此,在牛粪分解的早期,温度、降水和无脊椎土壤动物在牛粪其分解和养分释放过程中起着重要作用。
3.2 牦牛粪添加对土壤理化性质的影响
本研究表明,牦牛粪添加显著增加了SMC,这与以前的研究结果一致[10,33-34],主要是由于粪便吸收了强烈的太阳热辐射从而阻止了土壤中水分的蒸发。同时也发现牛粪添加显著降低了土壤的pH。Aarons等[35]也观察到牛粪添加降低了表层土壤(0−5 cm)的pH。相反,一些研究结果表明,粪便沉积增加了土壤的pH[36-37],并且认为增加的原因是由于粪便中的碱性元素(钙和镁等)释放到土壤中所致[35]。在本研究中,一方面,由于环境温度较低和粪便分解时间较短,粪便中的碱性元素释放较慢,这可能不足以增加土壤的pH;另一方面,牦牛粪在植物生长季节的沉积会造成活体植物窒息死亡,这些植物残体的分解可能向土壤中释放大量的酸性物质[3,38]。另外,牦牛粪添加显著增加了土壤DOC和DON含量。在初始分解阶段,牦牛粪中的大部分DOC和DON通过淋溶进入土壤,牛粪窒息的植物中一些易分解的物质以DOC和DON的形式释放进入土壤[39-40],从而增加了土壤DOC和DON的含量。随着分解时间的推移,牦牛粪可以通过提供外源有机质和养分来改善土壤结构和肥力,从而刺激土壤微生物活性[41]。增强的微生物活性可以进一步促进土壤中原有的和新进入的有机质分解,从而释放出DOC和DON[42]。
图3 牦牛粪添加对土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮、β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶和脲酶的影响Figure 3 Effects of yak dung deposition on soil microbial biomass carbon, microbial biomass nitrogen,β-1,4-glucosidase,β-1,4-xylosidase, and soil urease
3.3 牦牛粪添加对微生物生物量和酶活性的影响
本研究表明,牦牛粪添加显著增加了土壤MBC和MBN含量,表明微生物利用牦牛粪便提供的碳和养分用于其生长和代谢的底物。牦牛粪为土壤提供了大量外源性养分和易于利用的碳,从而增加了微生物生物量碳/氮。同时,牦牛粪添加显著增加了BG,BX和URE酶活性,其他研究也得到了类似的结果[16,43]。土壤酶活性的增加主要归因于牦牛粪添加的可利用性有机物[43]。因此,牦牛粪沉积可以促进放牧高寒草地土壤碳的矿化和养分循环。
3.4 土壤理化性质,微生物量和酶活性之间的关系
土壤水分含量和pH在调节微生物活性方面起着重要的作用[44]。然而,在本研究中,土壤水分含量的变化并未引起酶活性的变化。可能是因为在整个研究期间,降水相对充足,尽管牦牛粪的添加总体上增加了土壤水分含量,但仅在第2次采样时才出现显著增加。此外,在本研究中土壤pH对土壤酶活性变化的影响较小,可能是因为牦牛粪添加对土壤pH的影响较小。
图4 土壤理化性质及微生物生物量与酶活性冗余分析(RDA)Figure 4 Redundancy analysis(RDA)of soil physicochemical properties,microbial biomass,and enzymeactivities
通过RDA分析发现,基质的可利用性(DOC和DON)是土壤酶活性变异的重要控制因子。这可能是因为DOC和DON包含了不同分子量的酶促反应的底物和最终产物[45]。粪便中的DOC和DON渗入土壤增加了微生物生长所需的底物并提高了酶的活性[46-47]。微生物生物量也是酶活性变异的重要控制因子。在其他研究中也得到了相同的结果[18]。此外,牦牛粪添加导致的基质可利用性的变化比土壤微生物生物量的变化在调控土壤酶活性中起着更重要的作用。在高寒草地,可溶性碳和养分含量相对有限,基质的可利用性可能是限制微生物生长及酶活性的最重要因素[48]。但值得注意的是,本次仅研究了短期内牦牛粪的分解,将来的研究应扩展至完全分解周期,以便全面深入了解牦牛粪分解在青藏高原放牧高寒草地土壤过程中的作用。
4 结论
牦牛粪添加显著增加了土壤水分含量以及土壤DOC和DON含量,降低了土壤的pH。同时,牦牛粪添加显著增加了土壤微生物生物量和酶活性。本研究结果表明,基质的可利用性和微生物生物量是控制土壤酶活性的关键因素。总之,牦牛粪的短期分解能够增加土壤可利用性基质和养分,促进土壤微生物活性及其酶的产生,对青藏高原高寒草地生态系统功能的维持具有重要的作用。