苏北某医院痤疮患者皮损局部体表皮肤菌群分析 *

王 睿,周圣宜,翁露璐,史哲毅,陈浩宇,周海园,徐国轩,白 莉

(南京医科大学康达学院:1.临床医学部;2.康复医学部;3.病原生物学与免疫学教研室,江苏 连云港 222000)

痤疮是一种由多因素致病的毛囊皮脂腺疾病，其中微生物的定植被认为是影响痤疮发病的关键因素[1]。皮肤表面本身即存在大量的常居菌和暂居菌，痤疮的产生是否是因暂居菌的感染，或是因皮肤常居菌中某些条件致病菌的失衡所致，目前尚无定论。本研究选取盐城市第一人民医院皮肤科门诊痤疮患者17例作为研究对象，分别收集患者痤疮皮损局部体表样本，并选取17例健康人作为对照组，分别进行需氧、厌氧培养，采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对培养分离出的细菌进行鉴定，对比两组样本之间菌群指标的差异，探究其在痤疮发病过程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 17例痤疮皮损局部体表样本，采自2018年7月至8月盐城市第一人民医院皮肤科确诊的痤疮患者，根据《中国痤疮治疗指南》[2]的痤疮分级标准分为轻度(Ⅰ级)、中度(Ⅱ、Ⅲ级)痤疮患者；患者年龄12～34岁，平均(19.7±5.7)岁；男10例，女7例。17例健康人群皮肤菌群样本，选择苏北某高校学生，平均年龄(19.6±1.2)岁，男7例，女10例。排除标准：过去2个月内局部或系统使用过抗生素、激素、维A酸类药物及免疫抑制剂；有胃肠道疾病、呼吸道疾病及其他系统性疾病，有其他皮肤疾病。

1.2方法

1.2.1实验仪器及材料 血琼脂平板(郑州安图生物工程股份有限公司)，厌氧产气袋(法国生物梅里埃公司)，隔水式恒温培养箱(上海索谱仪器有限公司)，MALDI-TOF-MS质谱仪(法国生物梅里埃公司；连云港市第一人民医院高新院区检验科提供)。

1.2.2实验方法

1.2.2.1菌群标本采集 用无菌棉拭子蘸取无菌生理盐水对痤疮患者取样部位进行清洁，去除面部灰尘；选择痤疮皮损状态完好，未破损区域，使用一次性采样拭子用力旋转擦拭皮损周围皮肤进行取样。健康人皮肤取样部位选择被试者额头无皮损区域皮肤，方法同痤疮患者皮损周围取样。将所取样本分别接种到2块血琼脂平板上。

1.2.2.2细菌的培养、分离和鉴定 将每份样本分别进行厌氧、需氧培养，其中厌氧培养的血琼脂平板放入厌氧产气袋中。厌氧产气袋可消耗袋中的氧气，释放出二氧化碳，形成适宜的厌氧培养环境。样本需氧培养24 h，厌氧培养48 h，挑取单个菌落分离纯化培养。纯化后的菌株使用MALDI-TOF-MS质谱仪，选择VITEK MS质谱检测系统进行鉴定。

2 结 果

2.1痤疮患者皮损局部体表菌群检测结果 17例痤疮患者共分离出7种39株细菌。主要检出菌种为表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、头状葡萄球菌。见表1。

表1 痤疮患者皮损局部体表菌群检测结果(n=39)

2.2健康人皮肤菌群检测结果 17例健康人皮肤体表共分离出18种共53株细菌。主要检出菌种为表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌。见表2。

表2 健康人皮肤体表菌群检测结果(n=53)

3 讨 论

痤疮的发病机制并不完全清楚，目前普遍认为痤疮发病与内分泌失调及微生物在毛囊皮脂腺内定植等因素有关[3-4]。而随着微生态学的发展，人们开始关注皮肤微生态失衡与痤疮发病的相关性。本研究中，表皮葡萄球菌是痤疮患者皮损局部体表和健康人皮肤表面样本中绝对优势菌种，而痤疮丙酸杆菌在痤疮组样本中的检出率较高(χ2=4.25，P<0.05)。痤疮丙酸杆菌可能是主要的痤疮致病菌，与相关研究结果一致[5]。

另一方面，本研究中健康人的皮肤检出细菌种类数明显多于痤疮患者(t=2.167，P<0.05)，皮肤表面菌群的高多样性可能于皮肤的健康息息相关。YANHAN等[6]研究发现，表皮葡萄球菌会通过发酵甘油等途径抑制痤疮丙酸杆菌的过度生长。而对于同样是微生物感染导致的炎症性疾病——特应性皮炎(AD)，KONG等[7]研究发现，AD近期治疗组及健康组皮肤菌群多样性均高于患病组，并指出AD严重程度的恶化与皮肤菌群多样性的降低之间有很强的相关性。此外，还发现表皮葡萄球菌在AD爆发期与金黄色葡萄球菌同时流行，该一致性可能是表皮葡萄球菌的一种补偿作用机制，以控制金黄色葡萄球菌的增加。TERUAKI等[8]发现，具有抗菌活性的凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)菌株在健康人群中很常见，但在病例组中很少见，同时还发现将抗菌CoNS重新引入患者体内，可以减少金黄色葡萄球菌的定植。由此可以看出，皮肤细菌会通过相互作用，以及与其他致病菌和人体细胞相互作用，营造出一个相对健康稳定的皮肤微生态[9]。

最近已有研究通过高通量测序对于痤疮面部皮肤微生物群落变化进行研究，发现痤疮面部皮损区与无皮损局部体表的细菌多样性较健康组显著下降，主要与痤疮丙酸杆菌与表皮葡萄球菌的显著性上升有关[10]。本研究中，虽然无法直接证明健康组的皮肤多样性高于痤疮组，但健康组患者所检出的菌株种数检出数要明显高于痤疮组，在一定程度上可以说明健康人皮肤菌群的高多样性。有研究发现，痤疮患者皮损体表与本人无皮损局部体表的菌群组成也相似[9]，这或许可以说明痤疮的发病可能与致病菌的继发感染有关，而皮肤体表的菌群变化也可能预示着痤疮进一步发展。目前，对于痤疮体表皮肤的微生态的研究还较少，皮肤微生态的失衡及皮肤菌群多样性的下降可能与痤疮的发生、发展相关。本研究样本量相对较小，这是本研究的一项不足之处，结论还需更大样本量证实。

本研究使用MALDI-TOF-MS质谱仪进行菌种鉴定，能够较准确地将可培养的细菌鉴定到菌种，可以更好地研究不同菌种对于人体健康的潜在影响，而本研究的局限性也在于不能研究无法培养的细菌。基于对16SrDNA的高通量测序，能对不可培养细菌进行鉴定，但其大多只能鉴定到属，只有部分可以鉴定到种水平，并且成本较高，在临床中无法大规模使用，而MALDI-TOF-MS与传统的微生物表型检测和生化检测方法相比，具有准确度高、灵敏度高、成本低、快速高效等优点，有良好的临床使用前景[11]，因此使用MALDI-TOF-MS质谱仪进行菌种鉴定也是有必要的。而未来的深入研究可结合16SrDNA测序、Shotgun等技术，以全面地研究皮肤菌群多样性与皮肤健康的联系。

总之，表皮葡萄球菌是痤疮患者皮损局部体表和健康人皮肤表面样本中绝对优势菌种；丙酸杆菌尤其是痤疮丙酸杆菌在各类样本中检出率较高，其可能是主要的痤疮致病菌；痤疮患者皮肤菌群检出种数相较于健康人明显下降；皮肤微生态的失衡及皮肤菌群多样性的下降可能与痤疮的发生、发展相关。目前，对于皮肤微生态的研究还处在起步阶段，本研究通过对于痤疮皮肤菌群组成的初步探究，引出了皮肤微生态与痤疮患病的相关性，但此相关性还需要进一步的研究来证实。研究方向从针对单独一个菌种的研究向对多个菌种相互作用及人体皮肤微生态组成的研究的转变，将会为治疗痤疮提供新的思路。