响应面法优化白首乌多糖超声辅助提取工艺及其结构表征

朱和权，冯 进，李春阳, ，吴承东，张 明，Chuon Mony Roth

（1.南京农业大学食品科技学院, 江苏南京 210095；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所, 江苏南京 210014；3.盐城市新洋农业试验站, 江苏盐城 224005；4.柬埔寨农业渔业部农产品和食品实验室, 金边 10103）

植物多糖具有抗氧化[8]、调节免疫[9]、降血糖[10]、抗肿瘤[11]、调节肠道菌群[12]等多种药理作用。植物多糖的提取技术有很多，除了传统的水提醇沉法，还有酶法[13]、超声波提取法[14]、酸提法[15]、碱提法[16]及新兴的微波辅助提取法[17]和亚临界水萃取法[18]等。超声波法提取多糖具有效率高、提取时间短、提取温度低以及操作简单等优点，Gu等[19]采用响应面法优化了超声波提取慈姑多糖的工艺，并发现超声波法提取到的慈姑多糖具有良好的免疫调节活性。由于白首乌中淀粉含量较高，采用传统水提醇沉法提取时需要加入α-淀粉酶及糖化酶处理，导致白首乌多糖得率偏低[20]。为了提高白首乌中非淀粉多糖的得率，本文根据白首乌中淀粉在较低温度下不溶水的特性，选择超声波法在较低温度下提取白首乌中非淀粉多糖，从而避免了通过α-淀粉酶-糖化酶联用法除淀粉导致的多糖的损失。采用响应面法对超声波提取工艺进行优化，同时对超声波法提取的白首乌多糖结构进行初步结构表征，为日后对白首乌多糖结构的进一步解析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白首乌粉末 盐城果老首乌科技有限公司提供；无水乙醇，苯酚、浓硫酸、溴化钾 为国产分析纯；单糖标准品（岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸）及葡聚糖系列标准品 Sigma公司。

L3-5K台式低速离心机 湖南可成仪器设备有限公司；EU-2600R紫外可见分光光度计 上海昂拉仪器有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；RE-52AA型真空减压旋转蒸发仪、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；KQ-400DE数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白首乌多糖的提取 称取100 g白首乌超微粉末于烧杯中以蒸馏水作为提取溶剂，按照一定液料比、超声功率、超声温度及超声时间进行提取，提取结束后，将提取液倒入离心杯中，以4000 r/min的转速离心10 min。将上清液转入旋蒸瓶，旋转蒸发至1/4体积，随后采用Sevag法[21]除蛋白，加入4倍体积的无水乙醇置于4 ℃条件下过夜醇沉。将醇沉液于4000 r/min离心10 min，弃去上清液，将沉淀用80%的乙醇洗涤三次，最后用去离子水将沉淀复溶，透析48 h后冻干，得白首乌多糖。

1.2.2 单因素实验 按照1.2.1中的提取方法，实验基本条件定为：液料比20:1 mL/g，超声时间40 min，超声功率300 W和超声温度40 ℃。因素实验条件为液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、超声功率（200、250、300、350、400 W）和超声温度（20、30、40、50、60 ℃），分别考察液料比、超声时间、超声功率和超声温度对白首乌多糖得率得影响。

1.2.3 响应面优化试验设计 在单因素实验结果的基础上采用Box-Benhnken的中心组合设计对超声辅助提取白首乌多糖工艺进行优化，响应面优化试验因素和水平表见表1。根据响应面优化设计试验结果进行验证实验，并比较预测多糖得率与实际多糖得率。

表1 响应面分析试验因素及水平表设计Table 1 Independent variable and their levels of response surface methodology

1.2.4 白首乌多糖含量得测定 采用硫酸-苯酚法[22]检测粗多糖中多糖含量，绘制得葡萄糖标准曲线为Y=15.65x-0.00742（其中Y为吸光度，A；x为葡萄糖浓度，mg/mL），R2=0.9998，按照公式（1）计算多糖得率：

刘训峰在讲话中表示，与临港的战略合作是国资联手开发桃浦智创城的新起点、新篇章，也是双方开启未来合作的新契机，未来将继续加强良性互动，实现共同发展。

式中，y：超声波提取多糖得率，%；C：由标曲计算所得多糖浓度，mg/mL；V：定容体积，mL；N：稀释倍数；m：测定所用得粗多糖质量，mg；M：粗多糖质量，g；W：提取用白首乌粉末质量，g。

1.2.5 白首乌多糖的理化性质研究

1.2.5.1 白首乌多糖的单糖组成测定 白首乌多糖的单糖组成的测定采用离子色谱法（IC）[23]。取干净的色谱瓶，称量多糖样品5 mg，加入配制好的2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液，121 ℃加热2 h。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2～3次。加入无菌水溶解，过0.22 μm微孔过滤膜后，供进样分析。

仪器配置及检测条件：Thermo ICS5000+离子色谱系统，电化学检测器，CarboPac PA20液相色谱柱；淋洗程序：0.1 mol/L NaOH 淋洗液，0.5 mL/min流速。

1.2.5.2 白首乌多糖的分子量分布测定 白首乌多糖的分子量分布使用高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）测定[24]。将样品充分溶解于流动相中，用微孔过滤膜过滤后供进样。以葡聚糖标准品（Mw180、Mw2700、Mw9750、Mw36800、Mw135350）制作校正曲线。校正曲线为lgMw=-0.2679tR+10.8092 ，其中Mw为标准样品的平均相对分子量，tR为保留时间（min），R²=0.9956。

仪器配置及检测条件仪器：Waters1525 高效液相色谱仪（2414示差折光检测器和Empower3工作站），Ultrahydrogel™ Linear 300 mm×7.8 mm×2 μm色谱柱；淋洗程序：0.1 mol/L NaNO3淋洗液，流速为0.9 mL/min。

1.2.5.3 白首乌多糖的红外光谱测定 取2 mg干燥样品与200 mg KBr混合并研细均匀，压成薄片，傅里叶红外光谱仪在4000～400 cm-1进行红外光谱扫描。

1.2.5.4 白首乌多糖溶解度测定 白首乌多糖的溶解度测定参考Huang等[25]的方法。称取500 mg的白首乌多糖样品，溶解于5 mL蒸馏水中并且在常温下搅拌6 h，随后在3000 r/min转速下离心10 min，计算上清液体积，收集沉淀并烘至恒重，实验重复3次。白首乌多糖的溶解度根据公式（2）计算：

式中，y：白首乌多糖的溶解度，mg/mL；M：多糖样品质量，mg；m：烘干后沉淀质量，mg；V：上清液的体积，mL。

1.3 数据处理

单因素实验数据分析及显著性检验采用Origin9.6软件进行分析，响应面优化实验采用Design-Expert 8.0.6软件进行设计及结果与方差分析，显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 液料比对超声波辅助提取白首乌多糖得率的影响 由图1可知，随着液料比的增加，白首乌多糖得率逐渐升高，当液料比为20:1 mL/g时，白首乌多糖得率最高，此时多糖得率为1.14%。这是因为，当液料比较低时，溶剂与样品接触不充分从而导致提取不彻底。随着液料比的继续增加，多糖的得率呈下降趋势，这可能是因为随着液料比的增加使随后的料液的分离浓缩操作难度增加，导致多糖的损失增加。因此选择液料比20:1 mL/g。

图1 液料比对白首乌多糖得率的影响Fig.1 Effect of solvent to material ratio on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.2 超声时间对超声波辅助提取白首乌多糖得率的影响 由图2可知，随着超声时间的增加，白首乌多糖得率逐渐升高，当超声时间为40 min时，白首乌多糖得率最高，此时多糖得率为1.25%。这是因为，随着时间的增加，多糖得率增加，当超声时间为40 min时，多糖已经基本溶出，此时多糖得率为1.25%。随着超声时间的继续增加，不会提高白首乌多糖的得率，反而使部分小分子多糖降解，导致得率下降[26]。因此选择超声时间40 min。

图2 超声时间对白首乌多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.3 超声功率对超声波辅助提取白首乌多糖得率的影响 由图3可知，随着超声功率的增加，白首乌多糖得率逐渐升高，当超声功率为350 W时，白首乌多糖得率最高，此时多糖得率为1.27%。这是因为随着超声波产生的空穴效应和震动利于多糖的溶解。随着超声功率的继续增加，多糖得率呈下降趋势，这是因为过高的超声波功率会导致多糖的降解[27]，因此选择超声功率350 W。

图3 超声功率对白首乌多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.1.4 超声温度对超声波辅助提取白首乌多糖得率的影响 由图4可知，随着超声温度的增加，白首乌多糖得率逐渐升高，当超声温度为50 ℃时，多糖得率最高为1.29%，这是因为温度的升高可以提高多糖的溶解度。随着超声温度的继续升高，多糖得率开始下降，这是因为当温度达到60 ℃时，有部分水溶性淀粉随多糖一起溶解，需要对提取液做去淀粉处理，在去淀粉的过程中导致白首乌多糖的损失。因此选择超声温度50 ℃。

图4 超声温度对白首乌多糖得率的影响Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.2 响应面优化试验优化

2.2.1 响应面试验结果 在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合原理设计了29组实验，结果见表2。试验结果使用Design-Expert 8.0.6软件进行拟合分析。

2.2.2 回归方程拟合及方差分析 对白首乌多糖得率的响应面试验结果进行回归分析，结果见表3。对四个因素进行回归拟合后得到回归方程：Y=1.31+0.12A+0.23B-0.11C+0.055D+0.12AB+0.10AC+0.080AD+0.045BC+0.052BD+0.098CD-0.21A2-0.39B2-0.21C2-0.33D2。由方差分析可知，校正系数R2=0.9796,R2Adj=0.9592；模型的P值小于0.0001，为极显著；失拟项P值大于0.05，不显著。这说明模型拟合度较好，说明实验的二次模型拟合度较高，可正确反映个因素与响应值之间的变化关系。由模型的方差分析可得出液料比与超声温度交互项（AD）对响应值有显著影响（P＜0.05），而液料比（A）、超声时间（B）、超声功率（C）、超声温度（D）、液料比与超声时间交互项（AB）、液料比与超声功率交互项（AC）、超声功率与超声温度交互项（CD）及各因素的二次项对响应值具有极显著影响（P＜0.01）。各因素对响应值的影响显著性排序为B＞A＞C＞D。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface method design and test results

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

两因素之间交互作用的响应面图见图5。两个因素之间的交互作用可以通过响应面表示出来，两因素交互项的三维图越陡峭，等高线呈椭圆则表明这两个因素的交互项对响应值的影响越显著。图中三维图的陡峭顺序为AB＞AC＞CD＞AD＞BD＞BC，即液料比与超声时间交互项、液料比与超声功率交互项、超声功率与超声温度交互项以及液料比与超声温度交互项三维图最陡峭，表明超声时间与液料比之间的交互作用、液料比与超声功率之间的交互作用、超声功率与超声温度之间的交互作用以及液料比与超声温度之间的交互作用对白首乌多糖得率的影响显著；从等高线来，BC与BD的等高线接近圆形，表明超声时间与超声功率之间的交互作用及超声时间与超声温度之间的交互作用对白首乌多糖得率的影响不显著（P＞0.05），这与模型的方差分析相一致。

2.2.3 验证实验 经Design-Expert8.0.6预测模型极值点，结果显示最佳提取条件：液料比21.96:1 mL/g、超声时间为43.63 min、超声功率为345.53 W、超声温度为51.45 ℃。在此最佳提取条件下白首乌多糖得率为1.39%。根据实际操作设计验证实验，其提取条件为：液料比为22:1 mL/g、超声时间为44 min、超声功率为350 W及超声温度为52 ℃，按此提取条件进行3次平行实验，实验结果为在此条件下的多糖得率为1.35%±0.02%，验证实验结果与预测值的误差为2.88%，误差较小，表明该模型拟合度良好，对超声波法提取白首乌多糖的工艺优化合理、有效。

图5 两因素的交互作用对白首乌多糖得率的响应面图Fig.5 Response surface plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3 白首乌多糖表征

2.3.1 单糖组成结果分析 由图6和图7可知，白首乌多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸组成，其含量分别为0.17%、1.66%、7.40%、10.51%、74.41%、0.79%、0.85%、0.36%、3.28%、0.57%。由白首乌多糖的单糖组成数据可以得出该多糖中葡萄糖含量最高，说明白首乌多糖的主要组成为葡聚糖，这对其结构解析具有一定的参考价值。

图6 单糖标准品的离子色谱图Fig.6 Ion chromatography of complex standard monosaccharides and uronic acids

图7 白首乌多糖的单糖分析离子色谱图Fig.7 Ion chromatography of of monosaccharide in polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3.2 分子量测定结果分析 由图8和表4可知超声波法提取的白首乌多糖分子量分布状况，其重均分子量主要集中在1.71×107、1.15×106、5.93×104Da，其多分散系数分别为1.40、1.55、1.65，峰面积比为14.28%、21.18%、64.54%。

2.3.3 白首乌多糖红外光谱分析 如图9所示，白首乌多糖在3297 cm-1左右处有一处较宽的吸收峰，该峰是由O-H伸缩振动引起的，在2915 cm-1处出现的吸收峰是由C-H伸缩振动引起的。这两个峰为多糖的特征峰。在1645 cm-1处出现的峰则是由-COOH伸缩振动引起的，说明白首乌多糖中存在-COOH，这一点与白首乌多糖的单糖组成测定结果一致[28]。此外在1200～950 cm-1处出现的一组较强的吸收峰是吡喃糖环上的醚键（C-O-C）的伸缩振动及羟基O-H变角振动引起的[29]。在850 cm-1处的吸收峰为β-吡喃糖苷键的特征吸收峰[30]。红外光谱扫描结果显示白首乌多糖中含有β构型的吡喃糖，同时白首乌多糖中含有一定的糖醛酸，这与其单糖组成测定结果一致。

图8 白首乌多糖相对分子量分布的高效液相色谱图Fig.8 HPLC sepectrum of relative molecular weight of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

表4 白首乌多糖分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of Cynanchum auriculatum Royle ex Wight polysaccharide

图9 白首乌多糖的红外吸收光谱图Fig.9 FTIR spectra of polysaccharides from Cynanchum auriculatum Royle ex Wight

2.3.4 白首乌多糖溶解度的测定 实验结果显示白首乌多糖的溶解度为（25.89±0.36）mg/mL，具有较好的溶解度。这可能是因为白首乌多糖中低分子量组分比较多从而使其具有良好的溶解度[31]。多糖的溶解度在功能性食品加工中具有重要的意义。可以考虑将其加入到饮料中，做成低端消费品，也可以将其加入到高端的功能性食品，提高其附加值。

3 结论

采用超声辅助提取白首乌多糖，在单因素实验的基础上以响应面法优化提取工艺，结果表明：模型拟合度较好，实验的二次模型拟合度较高，四个因素对多糖提取量影响顺序为超声时间（B）＞液料比（A）＞超声功率（C）＞超声温度（D），超声辅助提取白首乌多糖的最佳提取工艺参数为：液料比22:1 mL/g、超声时间为44 min、超声功率为350 W及超声温度为52 ℃，此时多糖得率为1.35%±0.02%。白首乌多糖结构表征结果表明：白首乌多糖由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸以及葡萄糖醛酸组成，重均分子量主要集中在1.71×107、1.15×106、5.93×104Da，具有一般多糖红外光谱吸收峰以及良好的溶解性，为白首乌多糖结构解析及工业应用提供依据。