Gal和PEI修饰磁性纳米颗粒载体介导的c-Met siRNA构建及其抗肝癌细胞效应观察

杨针，张越岳，张文智，卢鹏

中国人民解放军总医院海南医院，海南三亚 572000

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球居第5位，病死率居第2位［1-2］。多数患者在发现时已进展至晚期，失去了手术切除的机会，而通常的治疗手段如射频、动脉栓塞等总体疗效仍未能令人满意［3］。近年来，以RNA干扰（RNAi）技术为代表的基因治疗在肿瘤治疗方面取得较大进步，其通过选择性靶向干扰特定蛋白的表达来抑制肿瘤细胞的生长，已成为有希望的肿瘤治疗策略之一［4］。c-Met是肝细胞生长因子的受体，在肝癌中高表达，与肝癌的增殖、分化和血管生成相关［5-6］，被认为是肝癌中有希望的潜在基因治疗分子靶点。虽然RNAi在抗癌治疗中应用潜力很强，但其在体内半衰期短、缺乏靶细胞特异性且穿过细胞膜的转运差［7-8］，应用受到限制。因此，必须选择一种可稳定携带小干扰RNA（siRNA）同时具有靶向运输作用的载体。近年来，随着纳米技术的快速发展和广泛应用，医用纳米技术应用于肿瘤治疗中，已成为新的研究热点。因此，本研究的目的是构建一种新颖可行的siRNA运载体，能将siRNA递送到肝癌组织并能发挥RNAi作用抑制肿瘤生长。磁性纳米颗粒（SPIO）是靶向治疗的有效载体，具有独特的磁导向性和表面效应，可通过特异性修饰将药物选择性地定位到病灶部位，从而提高药物疗效，被广泛用于药物的靶向运输。通常siRNA与磁性纳米颗粒均为负电荷，如何将二者有效结合成为潜在难点。聚乙烯亚胺（PEI）是一种人工合成的阳离子，带有大量正电荷，通过正负电荷的相互作用与siRNA、SPIO结合，并可携带siRNA顺利通过细胞膜进入胞质中，从而发挥siRNA的RNAi作用［9］。研究发现，半乳糖（Gal）修饰的SPIO可与肝癌细胞表面特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体识别［10］，从而使SPIO被肝癌细胞特异性识别。2019年6月—2020年9月，我们以Gal、PEI修饰的SPIO（Gal-PEI-SPIO）［11］为载体，观察其介导的c-Met siRNA的抗肝癌细胞效应。

1 材料与方法

1.1 主要材料 肝癌细胞系MHCC-97H（美国ATCC公司），细胞培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；TRIzol RNA分离试剂（美国Invitrogen公司），SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE公司），氯仿，PCR试剂盒（Prime ScriptTMKit Reagent Kit with gDNA Eraser），CCK-8试剂（南京碧云天公司），共聚焦激光扫描显微（CLSM，日本Olympus公司），凝胶成像仪（Chemi Doc MP System，美国BioRad公司）；c-Met siRNA的序列为5"-CCACGTGAACGCTACTTAT-3"，NCsiRNA的序列号siN05815122147，均由广州锐博公司合成。

1.2 Gal-PEI-SPIO与siRNA的结合效率观察 采用琼脂糖凝胶电泳实验。将Gal-PEI-SPIO与siRNA按SPIO与siRNA不同质量比混合，室温孵育30 min以形成Gal-PEI-SPIO/siRNA复合物。通过3%琼脂糖凝胶电泳检测Gal-PEI-SPIO与siRNA的结合，若在琼脂糖凝胶的图像中缺少条带，表明siRNA与Gal-PEI-SPIO紧密结合。

1.3 Gal-PEI-SPIO对MHCC-97H的细胞毒性检测 采用CCK-8法。将MHCC-97H细胞接种96孔板并培养24 h，将Gal-PEI-SPIO/NCsiRNA按不同浓度转染细胞；培养24 h后用CCK-8试剂检测细胞存活率，从而评价不同浓度Gal-PEI-SPIO与siRNA复合物的细胞毒性。

1.4 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA纳米复合物在MHCC-97H细胞中的沉默效率观察

1.4.1 c-Met mRNA检测 采用q-PCR法。将MHCC-97H细胞以2×105/孔接种6孔板，每孔中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。24 h后用等量无血清的DMEM培养基冲洗替换培养基，将含Gal-PEI-SPIO与c-Met siRNA/NCsiRNA纳米复合物分别加入不同的孔中，37℃孵育6 h。然后用含血清培养基代替转染培养基，将细胞在37℃孵育24 h。用TRIzol试剂充分裂解细胞，收集细胞的总RNA；按照Prime ScriptTMRT试剂盒说明将mRNA逆转录成cDNA，并使用qPCR定量分析结果。c-Met引物序列：上游为5"-ATCTCGGAGCCACAAACTA‐CA-3"，下游为5"-CAGTCCCGACAAGGTAAACAAT-3"；内参β-actin引物序列：上游为5"-CATCCGTA‐AAGACCTCTATGCCAAC-3"，下游为5"-ATGGAGC‐CACCGATCCACA-3"。

1.4.2 c-Met蛋白检测 采用Western blotting法。Gal-PEI-SPIO与c-Met siRNA/NCsiRNA纳米复合物按照“1.4.1”转染MHCC-97H细胞48 h，用PBS洗涤干净后放置冰上；加入蛋白裂解液，使蛋白裂解液与细胞层面充分接触；加入5×loading buffer，混匀后煮沸10 min，然后-20℃保存。通过8%SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品，将含有目的条带蛋白的PVDF膜分别与小鼠抗β-actin抗体（1∶2 000）和小鼠抗c-Met抗体（1∶1 000）在4℃摇床过夜孵育。吸去一抗溶液后用TBST溶液充分洗涤，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000）在摇床上室温孵育1 h。使用发光液检测试剂检测PVDF膜上的蛋白信号强度，并用Imagine Lab进行图像分析，以目的条带与内参条带吸光度比值表示目的蛋白相对表达量。

1.5 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA纳米复合物影响MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力的观察

1.5.1 迁移实验 采用Transwell小室。Gal-PEISPIO与c-Met siRNA/NC siRNA纳米复合物转染MHCC-97H细胞，48 h后用胰蛋白酶消化并离心收集细胞；用DMEM培养基重悬细胞，使用细胞计数仪调整细胞密度2×105/mL。将Transwell小室放入24孔板中，在下室中加入500μL含10%血清的细胞培养液，上室中加入Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA或NC siRNA纳米复合物转染后不含血清的MHCC-97H细胞悬液150μL。培养24 h后，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，晾干后用0.1%结晶紫溶液染色20 min。在400×显微镜下随机选取6个视野，拍照并计数细胞总数，取均值即为迁移细胞数。

1.5.2 侵袭实验 采用包被有基质胶的Transwell小室，其他步骤同体外迁移实验。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，数据比较行t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gal-PEI-SPIO与siRNA的结合效率 琼脂糖凝胶电泳实验显示，在Gal-PEI-SPIO和siRNA以SIPO、siRNA质量比≥4∶1时，两者可以紧密结合。见图1。

图1 Gal-PEI-SPIO与siRNA的结合情况（琼脂糖凝胶电泳）

2.2 Gal-PEI-SPIO对MHCC-97H的细胞毒性 当在Gal-PEI-SPIO和siRNA以SIPO、siRNA质量比≥4∶1时，MHCC-97H细胞存活率迅速降低，表明细胞毒性大。所以，我们选择了SPIO、siRNA质量比为4∶1作为实验的最终比例。见图2。

2.3 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA纳米复合物在MHCC-97H细胞中的沉默效率 转染Gal-PEISPIO/c-Met siRNA纳米复合物的MHCC-97H细胞中c-Met mRNA及蛋白表达量分别为0.625±0.047、0.315±0.015，均低于转染Gal-PEI-SPIO/NCsiRNA纳米复合物MHCC-97H细胞的1.092±0.058、1±0.082（P均＜0.01）。

图2 Gal-PEI-SPIO纳米载体对MHCC-97H细胞存活率的影响（CCK-8法）

2.4 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA纳米复合物对MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力的影响 转染Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA纳米复合物的MHCC-97H细胞迁移和侵袭的细胞分别为（50.29±6.21）、（77.00±5.33）个，均低于转染Gal-PEI-SPIO/NC siRNA纳米复合物MHCC-97H细胞的（75.94±9.54）、（101.41±4.36）个（P均＜0.01）。见图3。

图3 Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA纳米复合物对MHCC-97H细胞迁移和侵袭能力的影响

3 讨论

目前，以RNAi为代表的基因治疗技术已广泛应用于肿瘤治疗中，成为有希望的治疗策略之一［12］；但受限于siRNA在体内半衰期短、缺乏靶细胞特异性以及穿过细胞膜的转运差等缺点，必须要选择一种可稳定携带siRNA同时具有靶向运输作用的载体。医用纳米技术应用于肿瘤治疗已成为研究热点，同时为RNAi治疗带来希望。在本研究中，我们研究了一种新型的siRNA纳米运载体。该运载体是基于Gal、PEI修饰的SPIO，可通过Gal特异性识别肝癌表面表达的去唾液酸糖蛋白受体，使得SPIO特异性地被肝癌细胞识别，从而将siRNA靶向作用到肝癌部位，降低对正常组织的损伤作用；同时能携带并保护siRNA顺利通过细胞膜，将siRNA递送到肝癌细胞胞质中，从而发挥siRNA的RNAi作用来抑制肿瘤生长。琼脂糖凝胶电泳实验结果显示，当SPIO与siRNA质量比≥4∶1时，siRNA可完全与纳米载体结合。同时，细胞活性检测显示，其质量比≥4∶1时细胞活性显著降低。因此，以SPIO与siRNA质量比4∶1作为本实验的转染比例。

c-Met是细胞生长因子的受体，其在肝癌组织中高表达，与肝癌的增殖、转移及血管生成等因素密切相关［13-14］。因此，c-Met基因也被认为是肝癌中有希望的基因治疗潜在分子靶点。本课题设计了针对c-Met的siRNA，并通过q-PCR、Western blotting法检测Gal-PEI-SPIO能否有效携带c-Met siRNA进入MHCC-97H细胞中发挥沉默效果；结果发现，Gal-PEI-SPIO可有效携带c-Met siRNA进入细胞，可显著降低c-Met在肝癌细胞中的基因水平，并能在蛋白水平抑制c-Met形成。这充分说明了该纳米载体可携带c-Met siRNA进入肿瘤细胞中，并发挥RNAi作用。此外，我们进一步验证了Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA复合物可抑制肝癌细胞迁移、侵袭的能力。由此可见，我们研制的Gal-PEI-SPIO/c-Met siRNA复合物在体外对MHCC-97H细胞有显著抗肿瘤活性，为肝癌的治疗提供了新的靶向策略，并为其在体内抗肿瘤活性的研究提供了重要基础。