醋酸钠林格液减轻创伤失血性休克大鼠肝炎性损伤的机制研究

宋 琦,李 艳,徐志鹏,杜召辉,姜 海,邱兆磊,王振杰*

(1蚌埠医学院第一附属医院急诊外科,蚌埠 233000;2蚌埠市第三人民医院五官科;*通讯作者,E-mail:ahbyfywzj@163.com)

创伤失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)是急诊外科常见的急危重症,也是导致相关病人死亡的重要原因。研究发现,早期未控制失血而继发的一系列失控性炎症级联反应是引起其高死亡率的主要原因之一[1,2]。创伤失血性休克导致大量的炎性因子释放诸如IL-1、IL-6、TNF-α等,如何早期控制失血、改善微循环、抑制炎症过度释放,阻断SIRS和MODS的发生是创伤失血性休克研究的热点[3,4]。肝脏是人体对THS协调反应的重要器官之一,肝衰竭是MODS的一个重要组成部分[5]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活是THS过程中介导MODS的重要一步。c-Jun N末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)属于MAPK家族,是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,JNK信号通路在肝损伤中起着重要调节作用[6]。醋酸钠林格液被称为液体复苏“第一线”晶体液[7],使用醋酸钠林格液行限制性液体复苏时能够明显抑制肝肺组织炎症因子的释放[8],但其减轻肝损伤的具体作用机制尚未见相关文献报道。醋酸钠林格液复苏是否通过抑制JNK信号通路的激活来减轻创伤失血性休克时肝组织的损伤,国内外相关文献未见报道。因此,本实验旨在通过观察醋酸钠林格液对创伤失血性休克大鼠肝炎性因子及JNK信号通路的影响,探讨其可能机制,为临床THS患者早期液体复苏治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级SD大鼠(上海杰思捷实验动物有限公司提供)共32只,雌雄不拘,体质量(285±25)g,年龄8-10周。在室温、湿度及光照均受控的标准环境中饲养7 d,然后进行实验。所有实验操作均按照“医学实验动物护理和使用指南”进行,并经蚌埠医学院实验动物管理及伦理委员会批准。

1.2 主要实验设备及试剂

Medlab-u/2cs型生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司);台式高速冷冻离心机、核酸浓度测定仪、qPCR仪(美国Thermo Fisher);SDS-PAGE电泳系统(美国BIO-Rad);0.9%氯化钠注射液、乳酸钠林格氏液(安徽环球药业股份有限公司),醋酸钠林格液(湖南康源制药有限公司);SuperScript Ⅲ RT反转录kit(美国ABI-invitrogen);一抗稀释液、二抗稀释液、JNK antibody以及MKP-1 antibody均购于北京百奥思科生物医学技术有限公司。

1.3 动物分组

选取SD大鼠进行实验,使用随机数字表法分组:休克未复苏组(n=8)、生理盐水组(n=8)、乳酸钠林格液组(n=8)和醋酸钠林格液组(n=8)。四组大鼠均制备成休克模型,生理盐水组、乳酸钠林格液组及醋酸钠林格液组于休克后60 min应用不同液体进行30 min液体复苏,复苏后观察4 h,休克未复苏组不予复苏。生理盐水组、乳酸钠林格液组、醋酸钠林格液组复苏后4 h取大鼠肝组织进行后续实验;休克未复苏组休克观察4 h取大鼠肝组织,进行后续实验。

1.4 休克复苏模型的建立

1.4.1 休克模型建立前准备 ①麻醉：称重后，通过大鼠腹腔按照1 ml ∶100 g比例，注射质量分数4%的水合氯醛，并联合异氟醚吸入麻醉大鼠。②消毒、铺巾：麻醉成功后仰卧位固定于恒温手术台上，双侧腹股沟区备皮，并用络合碘溶液消毒2-3遍后铺无菌治疗巾。③置管：使用无菌手术器械解剖游离出双侧股动脉及股静脉，分别置管、固定，使用2.5%的枸橼酸钠葡萄糖进行封管。右侧股动脉置管连接Medlab-u/2cs生物信号采集系统，持续监测平均动脉血压(mean arterial pressure，MAP)，通过左侧股动脉放血诱导休克，右侧股静脉进行休克后的液体复苏，将微量泵连接至左侧股静脉。

1.4.2 建立休克复苏模型 使用2 ml注射器(已提前以1 ∶10比例预充2.5%的枸橼酸钠葡萄糖0.2 ml),以2 ml/3 min速度由左侧股动脉放血,MAP维持在(35±5)mmHg之间,整个过程持续20 min。维持MAP在(35±5)mmHg之间60 min,期间可缓慢放血或回输自体血。分别应用对应的复苏液体对生理盐水组、乳酸钠林格液组与醋酸钠林格液组大鼠在30 min内完成限制性液体复苏。液体输注量以复苏液体量和失血量比例为3 ∶1进行,复苏后观察4 h取大鼠肝组织。休克未复苏组不予液体复苏,观察4 h取大鼠肝组织(标本冻存于-80℃冰箱中)。为弥补手术区域及呼吸道液体的丢失,在整个休克及复苏过程中,通过左侧股静脉输注生理盐水5 ml/(kg·h)。

1.5 实验观察指标

1.5.1 肝组织中TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表达 用Trizol法提取肝组织标本总RNA,将提取的RNA反转录成cDNA,建立扩增体系(20 μl),扩增引物见表1。扩增:按照95 ℃ 2 min预变性,循环1次;94 ℃ 20 s变性,60 ℃ 20 s延伸,循环40次;绘制曲线:72 ℃ 30 s绘制溶解曲线。结束后读取Ct值并计算mRNA的表达,采用2-ΔΔCt法计算表达量。

表1 目的基因引物序列

1.5.2 采用Western blot法检测JNK磷酸化和MKP-1乙酰化的蛋白在肝组织中表达 取约100 mg的冻存肝组织,使用PBS洗涤2次后,于匀浆管壶腹部剪碎,加入RIPA裂解液1 ml,然后放置在冰上进行研磨。抽提肝组织蛋白,在4 ℃冷冻离心机中离心10 min(12 000 r/min),取上清液,对蛋白质进行定量分析和浓度测定(参照BCA蛋白质定量试剂盒的方法)。将样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,后转膜至PVDF膜。5%脱脂奶粉于摇床上封闭1 h,加入对应的兔抗大鼠多克隆抗体(1 ∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜后,加入与HRP偶联的山羊抗兔Ig G(1 ∶5 000)二抗室温下孵育1 h,用TBST洗涤10 min,共3次,最后放置暗室曝光及显影定影(采用ECL法),FluorChem灰度分析软件进行分析。目的蛋白相对表达=(目的蛋白灰度/β-actin灰度)×100%。

1.5.3 肝组织病理学检查 肝组织用4%多聚甲醛溶液进行固定、石蜡包埋、切片、HE染色,在光镜下观察肺组织病理学变化。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较结果

休克未复苏组、生理盐水组、乳酸钠林格液组和醋酸钠林格液组大鼠体质量、基础平均动脉压经单因素方差分析,组间差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 四组大鼠体质量和基础平均动脉压比较

2.2 肝组织病理学改变

在光镜下观察:休克未复苏组肝细胞混浊肿胀明显、胞质淡染,可见大量炎性细胞浸润,肝窦及肝细胞间质淤血明显;生理盐水组和乳酸钠林格液组较休克未复苏组组肝细胞肿胀减轻,可见较多炎性细胞浸润;醋酸钠林格液组肝细胞混浊肿胀不明显,少量炎性细胞浸润,肝窦及肝细胞间质无明显淤血,与生理盐水组和乳酸钠林格液组相比,肝损伤及炎性浸润减轻(见图1)。

2.3 肝组织TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表达

与休克未复苏组、生理盐水组和乳酸钠林格液组相比,醋酸钠林格液组TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表达明显减少(P<0.01),IL-4 mRNA和IL-10 mRNA表达明显增加(P<0.01,见表3)。

表3 四组大鼠TNF-α mRNA、IL-4 mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA的表达

2.4 JNK磷酸化、MKP-1乙酰化的蛋白在肝组织中的表达

与休克未复苏组、生理盐水组和乳酸钠林格液组相比,醋酸钠林格液组JNK磷酸化的蛋白相对表达量减少(P<0.01);MKP-1乙酰化的表达增加(P<0.01,见图2)。

与休克未复苏组比较,*P<0.05,**P<0.01;与生理盐水组和乳酸钠林格液组比较,#P<0.05,##P<0.01图2 JNK磷酸化、MKP-1乙酰化的蛋白在肝组织中的表达水平Figure 2 Relative expression of JNK phosphorylation protein and MKP-1 acetylation protein in liver tissue of rats in four groups

3 讨论

全球每年死于失血性休克的患者约190万,其中接近80%死于创伤[2]。创伤失血性休克(THS)往往会引起机体的有效循环血量不足、组织灌注减少,进而激活体内诸如中性粒细胞、单核/巨噬细胞等释放出大量以白细胞介素和肿瘤坏死因子(TNF-α)为主的炎症介质,导致炎症微环境失调,引起全身炎症反应(SIRS),如不及时干预,最终可能进一步发展为全身多器官功能障碍(MODS),甚至死亡[9]。THS救治理念在于有效改善组织低灌注的同时能够减轻机体炎症反应,抑制炎症的进一步发展,减轻组织脏器的损伤,降低病死率[10]。

肝脏是THS时最先受累的重要器官之一,约20%的THS患者表现出一定程度的肝功能障碍[11]。肝损伤是SIRS进展加快并导致MODS的一个重要部分,考虑到肝脏在代谢、排泄和体内平衡机制中的作用,肝损伤是直接与机体损伤加重相关的脏器,肝细胞是可再生细胞,当肝脏在严重破坏后,仍有足够的修复弹性,因此针对性的治疗可能有效提高休克复苏的成功率[5]。相关的实验研究认为,醋酸钠林格液是失血性休克液体复苏的“第一线”晶体液[7],能够减轻组织损伤,提高失血性休克大鼠存活率,改善凝血功能[12],并且醋酸钠的代谢很少依赖于肝脏,不会引肝脏中醋酸的蓄积。本实验中结果表明,通过三种液体限制性液体复苏创伤失血性休克大鼠模型,醋酸钠林格液能够抑制肝脏组织促炎因子TNF-α、IL-6的产生,提高抑炎因子IL-4、IL-10的生成,肝组织病理结果也显示了休克未复苏组的肝组织损伤明显,醋酸钠林格液组相对于乳酸钠林格液组及生理盐水组肝组织炎性浸润最轻,这与先前的研究结果一致。但醋酸钠林格液进行液体复苏,减轻肝损伤的具体作用机制尚未见相关文献报道。

THS后引起全身性炎症反应的最早的信号传导途径目前仍知之甚少。JNK信号通路是MAPK家族一条相对重要的信号通路,可被创伤、休克等应激反应和TNF-α激活[13]。磷酸化的C-Jun N末端激酶(p-JNK)是一种中央代谢调节剂,TNF-α可通过JNK的活化来发挥其功能,TNF-α诱导的细胞死亡是JNK依赖性的[14]。有研究指出,在出血发生后不久,促分裂原活化蛋白(MAP)激酶中的JNK即在肝脏中活化,参与肝组织缺氧的早期反应过程。小鼠出血至25 mmHg 30 min会导致肝脏内JNK磷酸化显著增加(2.1倍),组织缺氧是激活出血后肝脏早期信号传导的关键因素[15]。在药物导致的肝损伤的研究中,JNK在对乙酰氨基酚(APAP)诱发的肝损伤中起着核心作用,抑制JNK激活来部分缓解乙酰氨基酚APAP诱导的肝损伤[16,17]。丝裂原激活的蛋白激酶磷酸酶1(MKP-1),是JNK的关键负调节剂。MKP-1具有抗凋亡和抗炎特性,可通过抑制JNK信号途径细胞凋亡和炎症[18]。Wancket等[19]报道指出,MKP-1能够通过抑制JNK活性保护小鼠免受APAP诱导的肝损伤。MKP-1表达水平的升高与p38和JNK活性的降低在时间上呈相关性,组织细胞中MKP-1表达的适度增加能够缩短p38和JNK活化的时间,并在一定程度上抑制了TNF-α和IL-6的产生[20]。本实验结果也证明了这一点,生理盐水组、乳酸钠林格液组、醋酸钠林格液组大鼠肝组织JNK磷酸化水平相对于休克未复苏组明显降低,而肝组织中MKP-1乙酰化水平高于休克未复苏组,并且醋酸钠林格液组中表达水平最高,表明在创伤失血性休克发生时,JNK会在肝脏中活化,通过液体复苏能够增加肝组织MKP-1乙酰化水平,从而抑制JNK磷酸化,减少促炎因子IL-6、IL-10的释放,减轻肝组织损伤及炎症反应。相关的研究指出:醋酸盐可以减弱JNK磷酸化的能力,通过减少细胞中促炎因子的释放,并提高抗炎因子的转录水平来调节细胞因子的平衡,从而减轻细胞的炎症反应[21]。因此我们推测,醋酸钠林格液相对于生理盐水和乳酸钠林格液,可能是通过醋酸盐的补充,提高大鼠肝组织中MKP-1乙酰化水平,从而抑制JNK信号通路的活化,调节炎性因子的释放,进而减轻了肝组织损伤及炎症反应。