退化湿地土壤酶活性分析

刘立伟 光辉 叶姗 叶银 梁薇

摘 要：选取退化湿地土壤样本，分别对不同样本的脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、过氧化氢酶及荧光素二乙酸酯酶活性进行了测定分析。结果显示，过氧化氢酶与蔗糖酶的活性变化规律与土壤理化性质中的总氮和有机质含量变化特点基本保持一致。土壤酶在土壤的发生和发育以及土壤肥力的形成和演化过程中起着关键性作用，探究湿地退化过程中土壤酶活性特征，对于揭示长江中下游浅水湖泊湿地退化机理具有重要意义。

关键词：武昌湖;湿地退化;酶活性

中图分类号 P941.78文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）10-0134-05

Analysis of Soil Enzyme Activity in Degraded Wetland

LIU Liwei et al.

（School of Materials and Environmental Engineering， Chizhou University， Chizhou 247000， China）

Abstract： In this paper， soil samples of degraded wetlands were selected， and the urease， sucrase， phosphatase， catalase and luciferin diacetate enzyme activities of different samples were measured and analyzed. Experimental analysis found that the changes of the activities of catalase and sucrase were basically consistent with the changes of the total nitrogen and organic matter content in the physical and chemical properties of the soil. Soil enzymes play a key role in the occurrence and development of soil and the formation and evolution of soil fertility. By exploring the characteristics of soil enzyme activity in the process of wetland degradation， it is of great significance to reveal the degradation mechanism of shallow water lake wetlands in the middle and lower Yangtze River.

Key words： Wuchang Lake; Wetland degradation; Enzyme activity

1 引言

湿地生态系统是陆地生态系统中最主要的碳库之一，在全球气候变化中起着关键性的作用，其具有强大的生态功能，具体体现在湿地社会价值、大气水热循环、截留沉降污染物、水源调蓄以及维护多样性生物等方面。我国湿地面积约占世界湿地总面积的10%，位居亚洲首位，世界第4位[1]。近几十年来，由于人类无序开发及不合理的利用，导致湿地面积急剧减少[2-3]，湿地生态系统结构和功能已发生了不同程度的退化[4]，部分湿地生态系统甚至消失。据水利部门调查得知，目前我國湖泊湿地只有20世纪50年代的1/3左右，河流湿地已消失了近3万条。长江经济带是我国经济实力最强的区域之一，也是我国湖泊、河流、沼泽等分布密集区，湿地面积达1154万hm2，约占全国湿地总面积的20%。但与新中国成立初期相比，其湖泊湿地面积较萎缩了近120万hm2，仅2000—2010年间，该区域的沼泽湿地就丧失了742.1km2，湖泊丧失220.7km2[5，6]。湖泊湿地的萎缩，将日益威胁着生态安全与经济社会的可持续健康发展。

土壤酶是具有专性催化作用的蛋白质，几乎参与了土壤中所有的生物化学过程，与有机物质分解、营养物质循环和能量转移等密切相关[7，8]，在湿地生态系统中发挥着重要而复杂的作用。土壤酶主要来自微生物，可分为氧化还原酶类、水解酶类、转移酶类和裂解酶类，其活性直接影响了分布微生物群落结构相关情况。因此，土壤酶活性可作为衡量湿地生态系统质量的指标之一[9]。

位于安徽省安庆市的武昌湖湿地，是皖西南沿江湖群的重要的组成部分，具有渔业养殖、调节径流、改善气候、区域旅游以及物种保护等重要的生态作用[10]。而近年来，湿地退化现象非常突出，湖面被大面积的菰草所占据，使得湖水面积减少了近70%，菰草的生长繁衍导致湖底变浅，泥沙淤积严重;涉水生物物种也因为湖泊湿地的景观变化而减少，生物多样性遭到破坏，直接影响了该地区的生态安全和区域可持续发展[11]。目前，有关土壤酶的领域目前研究较多的是酶的时空分布、酶的测定方法、影响酶的因素等方面，而关于退化湿地土壤酶活性方面的研究较少。为此，本研究以武昌湖湿地为对象，对土壤酶活性的特征进行了分析。

2 材料与方法

2.1 研究区概况 武昌湖位于安徽省西南部望江县境内，是皖河水系中最大的一块湿地。湖面东西长约28km，南北最大宽度8km。属北亚热带季风湿润气候区，四季分明，雨量充沛。该淡水湖湿地是以草本沼泽和湖泊为主的一块湿地，东西长约20km，南北7.5km。1993年修建的跨湖公路将武昌湖分割为上湖和下湖2个区域。湿地植被建群种主要以挺水植物菰草为主，高度在0.8～2.1m，且生长茂盛，盖度可达60%～70%，其他伴生种主要有莲子草、愧叶萍、丘角菱、水鳖、浮萍等[12]。

2.2 样品采集 本研究以武昌湖湿地菰草群落重新扎根在不同的微生物环境下生长后的菰草为对象，采取GPS定位，选择7组不同的样点S1、S1a、S2、S3、S4、S5、S6。S1、S1a、S2、S3、S4等5处长菰草，而S5、S6这2处未生长菰草。其中，S1、S1a、S2位于河滩边，S1样点取的是菰草根际土壤，该点较长时间处在有水环境中;S1a样点取的是根际水下沉积物;S2土壤取的是菰草根际土壤，该点短时间内处在有水环境中;S3样点位于河滩边埂上，菰草根际只有在丰水期的时候才会处于有水环境中;S4处菰草常年漂浮于水上生长，且根须处在水中，含水量较高，根际土壤较少，未接触到湖泊沉积物;S5、S6处未生长菰草，S5处位于河漫滩边，只有丰水期的时候被淹没;S6处位于河岸口，丰水期也不能被淹没。这7组样点的区别主要在于有无生长菰草，含水量的多少，根际土壤的多少（接触水下沉积物的多少）。用取样铲从7组样点各采集一份土壤装入无菌袋中带回后进行风干作为样本，分别对这7个样本土壤的脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、过氧化氢酶以及荧光素二乙酸酯酶（FDA酶）的活性进行测定并分析。

2.3 测定项目与方法 采用比色法测定脲酶活性，硫代硫酸钠滴定法测定蔗糖酶活性，磷酸苯二钠比色法测定磷酸酶活性，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性，滴定法测定FDA酶活性。

2.3.1 脲酶测定 采用比色法测定脲酶，其操作步骤如下：称取10g风干土样（过1mm筛），同时将其放于容量瓶（100mL）之中，加入甲苯（2mL）2min，加入pH值为6.7的柠檬酸盐缓冲液以及10%的尿素溶液（10mL），仔细混合后。将上述材料放于恒温箱中，恒温箱的温度为38℃，并将其静置24h，用蒸馏水（38℃）进行稀释，此时应注意观察其甲苯是否刚好在刻度之上，充分摇动之后过滤掉悬液并备用。在此基础上基于水代替基质，对照土样设计并进行试验，设置没有土壤的对照并检验其纯度。在容量瓶中放置上述溶液，加入蒸馏水使之变成10mL，并加入苯酚钠溶液及氯酸钠溶液。将所制成的混合试剂放置20min，并通过稀释混合物体直至刻度，选用1cm的比色槽，测定波长为578nm的比色并记录出其读数。此时可通过对比试试样品的对照样品消光值及上述样品所获得的消光值，并结合标准曲线获得氨态氮量。脲酶的活性以24h后单位土重产生的NH3-N的重量（mg）表示。

2.3.2 蔗糖酶测定 采用硫代硫酸钠滴定法测定土壤蔗糖酶活性，其具体操作步骤如下：称取10g风干土样（过1mm筛），同时将其放于容量瓶（100mL）之中，并加入甲苯（1.5mL）。长温下放置15min之后，即可加入磷酸盐缓冲液、蔗糖溶液（前者的pH值为5.5）在混合完成后，加其放入恒温箱中（温度同上均为37℃）并培养23个h，用蒸馏水（38℃）进行稀释，此时应注意观察其甲苯是否刚好在刻度之上，充分摇动之后过滤掉悬液并备用。在此基础上基于水代替基质，对照土样设计并进行试验，设置没有土壤的对照并检验其纯度。在容量瓶中放置上述溶液，加入蒸馏水使之变成10mL。并加入苯酚钠溶液及氯酸钠溶液。将所制成的混合试剂放置60min，取未经过滤的透明液20mL，并测定出其原糖。在进行测定时，应注意区分庶糖溶液与无庶糖溶液。将待测液20mL同菲林溶液10mL一起加入三角瓶之中，同时混入蒸馏水（20mL）。将上述所形成的三角瓶及其材料均放于水浴中10min，取出三角瓶后将其放于自来水流下让其自然冷却25℃，此时即可加入1∶3的稀硫酸4mL以及碘化钾溶液3mL，对上述混合液采用0.1mol/L硫代硫酸钠进行滴定。一般以硫代硫酸钠mg数说明24h单位土重消耗。

2.3.3 磷酸酶测定 采用磷酸苯二钠比色法测定磷酸酶活性，其操作步骤如下：称取10g风干土样（过1mm筛），同时将其放于容量瓶（100mL）之中，加入甲苯（1.5mL）處理15min，在此基础上需要液入缓冲液、磷酸苯二纳溶液。同时将上述材料放于恒温箱中，恒温箱的温度为38℃，并将其静置24h，用蒸馏水（38℃）进行稀释，此时应注意观察其甲苯是否刚好在刻度之上，充分摇均匀之后过滤掉悬液并备用。在此基础上基于水代替基质，对照土样设计并进行试验，设置水代替基质（10mL）对照并检验其纯度。在容量瓶中放置上述溶液，加入缓冲液使之变成10mL，此后加水滤液，加入1mLGibbs试剂。混合反应物，在静置20min后，以刻度为标准稀释混合物，并记录其波长在578nm处24h的读数，并做好记录。对比对照样品以及待测样品两者的消光值，即可求解出其酶活性以24h后单位土重释放的酚的质量（mg）表示。

2.3.4 过氧化氢酶测定 采用高锰酸钾滴定法检测过氧化氢酶活性，其具体操作步骤如下：称取10g风干土样（过1mm筛），同时将其放于三角瓶之中（150mL）在其中注入氧化氢溶液、蒸馏水。设置对照即不加土样，但是加入上述材料。此后即可塞紧瓶塞，并将其放于120r/min往返式摇床上，使其得以充分振荡30min，此后需要注入硫酸（5mL1.5mol/L）使其终止反应，采用到处密滤纸进行过滤，利用高锰酸钾溶液（0.002mol/L）进行滴定使之变成微红色，以30min 1g土壤的高锰酸钾的毫升数表示氧化氢酶活性。

2.3.5 FDA酶活（荧光素二乙酸酯酶活）测定 采用滴定法测定FDA酶活性，其操作步骤如下：称取5g新鲜的土壤（过2mm筛），同时将其放于容量瓶新鲜土壤，置于三角瓶（50mL）中，同时加入15mL60mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH7.6），加入荧光素二乙酸（FDA）（0.2mL1000μg/mL）储备液，并使其放于恒温振荡培养箱之中，培养20min待结束后可加入包含甲醇、氯仿的混合液（15mL）使其终止反应，加入瓶塞之后使之得以充分振荡，在此基础上可将混合液转移至离心管（50mL）之中，2000r/min离心3min。过滤于50mL三角瓶，吸取1～10mL滤液按标准曲线绘制的操作手续，测定490nm处比色测定。基于1h的土壤以及150℃的干热灭菌进行对照实验土壤的基质。荧光素二乙酸酯酶活性，以20min每g土壤消耗荧光素的Hg数来表示。

3 数据分析

3.1 菰草根际土壤脲酶分布特征 脲酶属于酰胺酶的一种，可用于说明土壤中氮素的循环现象，有助于分解肽键。与此同时，其土壤的微生物数量、脲酶活性以及总氮、有机质的含量等几者之间均存在一定的联系[9，13-14]。大多数细菌、真菌和高等植物均具有脲酶，它是土壤中主要的水解酶类。武昌湖湿地菰草根际土壤脲酶活性的大小按照S1>S1a>S3>S2>S4>S5>S6的规律逐渐降低（表1），其中样点S1处为脲酶活性的最高值点，为0.042mg/g·h，样点S6处的脲酶活性大小为0.017mg/g·h，是所有样品中的最低值点。常年外在环境扰动较小的未生长菰草的样点S5和S6的脲酶活性明显小于其他的样点，而S4样点的脲酶活性与S5和S6的酶活性差异较小，这可能与S4样点的微环境有关，该环境下的菰草常年长时间漂浮在水上生长，其根际仅存在少量的土壤，常年被水淹没，而菰草需要的主要营养来源并不是根际土壤，从而导致S4处的脲酶活性与未长菰草区样点S5和S6处之间的脲酶活性相接近，且与其他样点间存在着明显的差异（图1）。武昌湖湿地菰草根际土壤脲酶活性的空间横向变化规律同其土壤有机质含量的变化规律总体相类似，这与凝聚土壤腐殖质、脲酶有关[15]。

3.2 菰草根际土壤蔗糖酶分布特征 研究表明，土壤的蔗糖酶活性与下述均具有正相关的关系：其一是水溶性;其二是腐殖质;其三是微生物活动及其数量[13，16，17]。土壤中的蔗糖酶具有加速分解蔗糖，使之成为果糖以及葡萄糖的能力，提高土壤的熟化度即意味着可强化蔗糖酶的活性。蔗糖酶可用于说明土壤的肥力水平及其熟化程度。由图2可知，土壤蔗糖酶活性在0.132～0.284mg/g·h，其蔗糖酶活性的最大值在S1样点，样点S6处的蔗糖酶活性最低。各样点土壤蔗糖酶活性按照S1>S2>S1a>S4>S5>S3>S6的规律依次递减（图2）。样点S5、S3、S6之间的土壤蔗糖酶活性基本相同，而这3种环境下土壤的含水率明显低于其他各样点，从而可得出土壤中水分含量可能成为影响该环境下土壤蔗糖酶活性的主导因子的结论。这与相关学者研究湿地土壤酶活性时所得到的结论基本保持一致[14，18-19]。

3.3 菰草根际土壤磷酸酶分布特征 有机磷在植物的磷素营养物质中占有一定的比例，而有机磷往往要在磷酸酶的酶促作用下才能够进行水解，并转化为可被植物直接利用的形态[20-21]。本实验证实了土壤微生物具有矿化土壤中含磷有机物的作用，且有助于提升其磷酸活性，可用于说明包括磷在内的土壤肥力情况[22]。武昌湖湿地菰草根际土壤磷酸酶的活性在0.085～0.418mg/g/h，其中磷酸酶活性的最高值点是S6样点，S1a处的磷酸酶活性最低，土壤磷酸酶活性按照S6>S5>S3>S1>S4>S2>S1a的变化规律依次递减（图3），这与根际土壤理化性质中含水率的大小分布规律基本相反，所以可得出土壤含水率可能在一定程度上抑制了土壤磷酸酶活性的结论。

3.4 菰草根际土壤过氧化氢酶分布特征 过氧化氢酶是一种用于氧化氢氧化合物的物质，且几乎每一种生物体中都含有这一物质。很多细菌体的过氧化氢酶细胞占比达到了1%以上，具有转换能量、物质等作用。一般将其归为氧化还原。与此同时其强度、土壤中的微生物等均会影响到其过氧化氢酶的活性，这可说明其在微生物学上的强度情况[22]。

武昌湖湿地菰草根际土壤过氧化氢酶活性水平在1.5～3.2mLKMnO4/g·min，样点S1处的过氧化氢酶活性最高，而过氧化氢酶活性的最低值出现在样点S6处。各样点间过氧化氢酶活性按照S1>S2>S1a>S4>S5>S3>S6的顺序依次递减（图4），各样点间过氧化氢酶活性与样点所处的微环境以及土壤的理化性质之间并未发现明显的规律，这可能与土壤处于多相介质中且其环境极其复杂等因素具有一定的关系。另外，酶活性可能还受到季节、氧化还原电位、离子浓度以及土壤中的各种其他成分等直接或间接的，复合和多重的叠加影响[23，24]。

3.5 菰草根际土壤FDA酶分布特征 荧光素二乙酸是一种有可能被酶类水解的物质，比如脂肪酶、蛋白酶等等，形成酶促反应。学者将这一现象归为FDA酶，基于土壤的生物总体活性一般可用FDA酶进行表征说明[22，25，26]。武昌湖湿地菰草根际土壤荧光素二乙酸酯酶活在0.86～8.23μg/g·20min，其中S5样点的土壤荧光素二乙酸酯酶活性最低，S4样点的土壤荧光素二乙酸酯酶活性最高，并且两者之间的大小存在着明显的差异。各样点土壤的荧光素二乙酸酯酶活性按照S4>S1>S1a>S3>S2>S6>S5的规律依次递减（图5）。样点S5、S6荧光素二乙酸酯酶活性无明显差异，但这两点与其他各样点之间酶活性的差异较为明显。S4样点荧光素二乙酸酯酶活性显著高于其他样点，这可能是由S4样点常年被水淹没的特殊微环境所造成的。

4 结果与讨论

武昌湖湿地菰草根际土壤脲酶活性大小在0.017～0.042mg/（g·h），各样点间脲酶活性大小顺序为S1>S1a>S3>S2>S4>S5>S6;根际土壤的蔗糖酶活性和过氧化氢酶活性在各样点间规律表现高度一致，大小顺序均为S1>S2>S1a>S4>S5>S3>S6，其中蔗糖酶活性为0.132～0.284mg/（g.h），过氧化氢酶活性为1.5～3.2mLKMnO4/g·min;各根际土壤样点磷酸酶活性大小在0.085～0.418mg/（g·h），各样点间酶活大小规律按照S6>S5>S3>S1>S4>S2>S1a依次递减;土壤FDA酶活性大小规律按照S4>S1>S1a>S3>S2>S6>S5依次递减，在0.86～8.23μg/g·20min。

蔗糖酶活性与土壤中的腐殖质和有机质等因素呈正相关，过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%，且几乎每一种生物体中都含有这一物质。这可能是两者之间酶活性规律完全相同的原因之一，而且更为重要的是其总氮含量有机质的变化特点基本保持一致。其他3组则未形成如此显现的变化规律，客观上来说这与处于相介质的土壤及其整个复杂的微环境均有一定的关系。除了与上述土壤理化性質有着紧密的联系之外，一般认为其还受到氧化还原电位和pH值等一系列其他因素的影响。

参考文献

[1]卞建民，林年丰，汤洁.吉林西部向海湿地环境退化及驱动机制研究[J].吉林大学学报：地球科学版，2004，34（3）：441-444.

[2]傅国斌，李克让.全球变暖与湿地生态系统的研究进展[J].地理研究，2001，20（1）：120-128.

[3]Rodriguez-Iturbe I.Ecohydrology：a hydrologic perspective of climate-soil-vegetation dynamies[J].Water Resources Research 2000，36（1）：3–9.

[4]Gitay H，Finlayson CM，Davidson N.A Framework for assessing the vulnerability of wetlands to climate change[J].2011.

[5]薛蕾，徐承红.长江流域湿地现状及其保护[J].生态经济（中文版），2015，31（12）：10-13.

[6]张阳武.长江流域湿地资源现状及其保护对策探讨[J].林业资源管理，2015（3）：39-43.

[7]Dick W A.Influence of long-term tillage and crop rotation combi-nations on soil enzyme activities[J].Soil Science Society of Amer-ica Journal， 1984， 48（3）：569-574.

[8]Yao X H， Min H， Lü Z H， et al.Influence of acetamiprid on soilenzymatic activities and respiration[J].European Journal of SoilBiology，2006，42（2）：120-126.

[9]朱海强，李艳红，李发东.艾比湖湿地典型植物群落土壤酶活性季节变化特征[J].应用生态学报，2017，28（4）：1145-1154.

[10]周葆华，操璟璟，朱超平，等.安庆沿江湖泊湿地生态系统服务功能价值评估.地理研究，2011，30（12）：2296-2304.

[11]余瑞林，周葆华，刘承良.安庆沿江湿地景观格局变化及其驱动力.长江流域资源与环境，2009，18（6）：522-527.

[12]刘赵文，周葆华，寇乐勇，等.武昌湖典型退化湿地菰草根际微生物群落结构[J].地球与环境，2018，46（04）：339-347.

[13]包先明，程新锋，纪磊，等.不同退耕年限下菜子湖湿地土壤酶活性变化[J].土壤，2016，48（4）：692-697.

[14]张鑫，耿玉清，徐明，等.鄱阳湖湖滨湿地土壤酶活性及影响因素[J].北京林业大学学报，2014，36（1）：34-40.

[15]周礼恺.土壤酶学[M].北京：科学出版社，1987：178-179.

[16]吴树坤，刘梅，邓杰，等.不同品质浓香型窖泥的酶活与微生物群落的相关性[J].食品与发酵工业，2018（1）：19-24.

[17]何钢，袁德义，刘贤桂.油茶低产林土壤改良对土壤养分及土壤酶活的影响[J].中南林业科技大学学报，2011，31（3）：76-80.

[18]Vo N X Q， Kang H.Regulation of soil enzyme activities in constructed wetlands under a short-term drying period[J].Chemistry & Ecology， 2013，29（2）：146-165.

[19]万忠梅，宋长春，郭跃东，等.毛苔草湿地土壤酶活性及活性有机碳组分对水分梯度的响应[J].生态学报，2008，28（12）：5980-5986.

[20]Dunn C， Jones T G， Girard A， et al.Methodologies for extracellular enzyme assays from wetland soils[J].Wetlands， 2014，34（1）：9-17.

[21]关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京：农业出版社，1986.

[22]李振高.土壤与环境微生物研究法[M].北京：科学出版社，2008：412-413。

[23]王理德，王方琳，郭春秀，等.土壤酶学研究进展[J].土壤，2016，48（1）：12-21.

[24]张焱华，吴敏，何鹏，等.土壤酶活性与土壤肥力关系的研究进展[J].安徽农业科学，2007，35（34）：1139-1142.

[25]蒋炳伸，李鸿雁，杨喜田.应用荧光素二乙酸脂水解酶活性研究不同绿地土壤微生物活性[J].河南农业科学，2011，40（8）：130-133.

[26]王振芬.三江平原湿地不同土地利用方式对土壤养分及酶活性的影响[J].水土保持研究，2019，26（02）：43-48.

（責编：张宏民）