Ⅰ型和Ⅱ型酮病奶牛系统性炎症和肝损伤状态的分析与比较

陈喜莹，范明赫，白洪旭，李 伟，宋玉祥，李心慰，刘国文，王 哲，杜希良，李小兵

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

奶牛酮病是围产期高发和频发的一种以能量代谢障碍为基础的营养代谢紊乱性疾病。产后奶牛能量摄入不能满足能量需求，导致机体处于能量负平衡状态，发生体脂动员，生成大量游离脂肪酸(NEFA)，在肝脏中不完全氧化生成大量酮体(β-羟丁酸(BHBA)、乙酰乙酸和丙酮)并释放到血液中。当血液中酮体含量高于1.2 mmol/L时，便可诊断为酮病[1]。酮病奶牛通常表现为精神沉郁、消化机能紊乱、产奶量下降、体质量减轻等，严重影响奶牛的免疫性能、生产性能和经济效益[2]。另外，酮病增加其他疾病的患病风险，包括乳房炎、子宫内膜炎、真胃变位和胎衣不下等[3]。因此，酮病的防治对于围产期奶牛健康至关重要。

根据酮病发病机理的差异，HOLTENIUS等[4]将奶牛酮病分为Ⅰ、Ⅱ型酮病。Ⅰ型酮病又称饥饿型酮病，主要由于泌乳对糖的需求超过糖异生的能力，血浆中葡萄糖(Glu)和胰岛素的浓度降低，进而引起脂类不完全氧化作用加强，导致酮体生成增加。Ⅰ型酮病奶牛以低血糖、低胰岛素、高NEFA和高血酮为特征，多发生于产后的3～6周[2]；Ⅱ型酮病与人类Ⅱ型糖尿病相似，其病理基础是脂肪肝和胰岛素抵抗(IR)，由于脂质在肝细胞中蓄积诱发胰岛素抵抗，导致肝脏对脂质完全氧化过程减弱，使酮体生成增加。此外，肝脏胰岛素耐受性降低减少了Glu的吸收，故Ⅱ型酮病以高血糖或血糖正常、高胰岛素和高NEFA血症为特征，且常伴发乳房炎等其他疾病，常发生于产后早期(泌乳5～15 d)[5]。

已有研究表明Ⅰ型酮病奶牛血清中包括结合珠蛋白(HP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)和肿瘤坏死因子(TNF-α)等炎性相关因子的浓度增加[6]，说明Ⅰ型酮病奶牛存在系统性炎症，然而Ⅱ型酮病奶牛是否存在类似情况尚不清楚。另外，有研究报道患有肝损伤的产后奶牛更容易发生Ⅱ型酮病[7]。肝脏是糖代谢的重要器官，肝脏受损，机体出现糖代谢异常，胰岛素作用减弱，机体呈现不同程度的胰岛素抵抗，导致血糖不能及时进入细胞供能[8]。因此，肝功能受损引起的糖代谢紊乱可能是引起机体发生IR，诱发Ⅱ型酮病的重要因素。虽然已有报道Ⅰ型酮病奶牛表现为肝损伤[9]，但Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛肝损

伤程度是否存在差异并不清楚。因此，本试验通过分析与比较Ⅰ、 Ⅱ型酮病血液中炎性和肝功能相关指标的差异，剖析不同类型酮病奶牛的发病机理，以期为酮病的诊断、防治及监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物荷斯坦奶牛均选自吉林省长春市某奶牛场，所有奶牛接受常规体检确保没有其他并发症的存在。根据Glu、BHBA和NEFA的含量选择健康奶牛20头、Ⅰ和Ⅱ型酮病奶牛各20头。健康奶牛的判断标准包括：无异常的临床表现、各项临床指征(呼吸、脉搏、体温等)均正常，血液生化指标BHBA<1.2 mmol/L、Glu>3.0 mmol/L；Ⅰ型酮病奶牛的判定标准为BHBA>1.20 mmol/L、Glu<2.80 mmol/L；Ⅱ型酮病奶牛的判定标准为BHBA>1.20 mmol/L、Glu>3.0 mmol/L[10]。

1.2 样本采集通过临床诊断，分别筛选健康和Ⅰ、Ⅱ型酮病的奶牛各20头作为试验对象，于清晨饲喂前颈静脉无菌采集试验牛的血液样本。所采静脉血置于10 mL肝素钠抗凝剂内用于分离血浆，10 mL置于未加抗凝剂的离心管中用来分离血清，3 800×g离心10 min，收集血浆(血清)，做好标记后，-20℃短期保存，-80℃长期保存(6个月内)。

1.3 试剂血液样品中Glu、NEFA和BHBA含量用Hitachi自动生化分析仪以及商用检测试剂盒检测；检测急性期反应蛋白HP、SAA的 ELISA 检测试剂盒购自CUSABIO 公司；炎性因子白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、TNF-α 的ELISA 检测试剂盒购自CUSABIO 公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。

2 结果

2.1 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛与健康奶牛临床参数和能量代谢指标的比较如表1所示，Ⅰ型酮病奶牛的体况评分(BCS)显著低于健康奶牛和Ⅱ型酮病奶牛，而Ⅱ型酮病奶牛的BCS高于健康奶牛和Ⅰ型酮病奶牛；Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的产奶量均显著低于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛产量更低。此外，Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的NEFA和BHBA均显著高于健康奶牛，而血糖(Glu)水平均显著低于健康奶牛，但Ⅱ型酮病奶牛的Glu水平高于Ⅰ型酮病。结果表明，Ⅰ型酮病奶牛存在能量负平衡；Ⅱ型酮病常发生于肥胖奶牛，表现为血液高NEFA和高Glu。

表1 健康奶牛与Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛临床参数和能量代谢指标比较(n=20)

2.2 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛与健康奶牛急性期反应蛋白的比较如图1所示，Ⅰ、Ⅱ型酮病中急性期反应蛋白SAA和HP的质量浓度均显著高于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的SAA和HP的质量浓度显著高于Ⅰ型酮病奶牛。结果表明，酮病发生时，机体存在损伤并触发急性反应，且Ⅱ型酮病奶牛的损伤程度要高于Ⅰ型酮病奶牛。

图1 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛血清中急性期反应蛋白SAA(A)和HP(B)的质量浓度

2.3 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛与健康奶牛炎性相关指标的比较如图2所示，Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量均显著高于健康奶牛，且这些促炎因子在Ⅱ型酮病奶牛血液中高于Ⅰ型酮病奶牛；抗炎因子IL-10的水平在Ⅰ、Ⅱ型酮病中显著低于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的IL-10水平低于Ⅰ型酮病奶牛。结果表明，酮病发生时，机体存在系统性炎症，且Ⅱ型酮病奶牛的炎性水平更高。

图2 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛血清中促炎因子IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)以及抑炎因子IL-10(D)的质量浓度比较

2.4 Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛与健康奶牛肝脏功能相关指标的比较检测Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的肝损伤指标，发现酮病奶牛血液AST和ALT的活性显著高于健康奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的AST和ALT活性高于Ⅰ型酮病奶牛(图3)；表明酮病奶牛表现为肝损伤，且Ⅱ型酮病奶牛的肝损伤程度更加严重。

图3 Ⅰ、Ⅱ型酮病和健康奶牛中肝损伤相关指标AST(A)和ALT(B)的活性比较

3 讨论

酮病是普遍发生于奶牛围产期的一种代谢性疾病，其发生与产后初期采食恢复缓慢及泌乳早期体内的能量无法满足泌乳需求所致的能量负平衡有关[11]。虽然Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛中均存在能量负平衡，但是由于Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的发病机理不同，其病理变化和代谢状态可能存在差异[2]。因此本试验比较分析了Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛的急性期反应蛋白(HP和SAA)、炎性相关指标(IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α)和肝损伤指标(ALT和AST)的差异，发现Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛均存在急性反应、系统性炎症和肝损伤，但Ⅱ型酮病奶牛更加严重。本试验为解析酮病，尤其是Ⅱ型酮病的发病机理提供数据支撑。

糖脂代谢紊乱是酮病奶牛的代谢特征[12]，本试验也发现酮病奶牛血液NEFA和BHBA的浓度显著高于正常奶牛，而高浓度的NEFA和BHBA具有脂毒性，能够引起急性反应[13]。SAA和HP是由肝细胞分泌到血清中的急性反应蛋白，当机体发生感染或损伤时，可迅速升高[14]。本试验发现酮病奶牛的SAA和HP水平均高于正常奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的SAA和HP水平均高于Ⅰ型酮病奶牛；这表明Ⅱ型酮病奶牛的机体损伤程度要高于Ⅰ型酮病奶牛。

急性反应常伴随着炎性反应的发生，另外有研究表明奶牛Ⅱ型酮病与人类Ⅱ型糖尿病相似[15]，且促炎细胞因子可作为评价Ⅱ型糖尿病严重程度的关键指标。本试验中，酮病奶牛的促炎因子水平均高于正常奶牛，且Ⅱ型酮病奶牛的促炎因子水平高于Ⅰ型酮病奶牛，表明Ⅰ、Ⅱ型酮病奶牛均存在炎性反应，且Ⅱ型酮病奶牛的炎性反应要高于Ⅰ型酮病奶牛，这与急性反应蛋白的表达是一致的。促炎因子TNF-α和IL-1β等在肝脏脂质代谢障碍引发脂肪肝的生成中发挥着重要的作用[16]。高水平TNF-α或IL-1β能够导致肝脏胰岛素抵抗，使血浆中的NEFA升高[17]。同时，促炎因子能够抑制脂肪细胞中脂蛋白脂肪酶(LPL)的活性[18]，从而使脂肪细胞脂解增强，提高血液NEFA含量。高浓度NEFA具有脂毒性能够使巨噬细胞分泌多种促炎因子，继而加剧肝脏和脂肪组织的脂代谢紊乱，形成一个恶性循环[19]。本试验中，Ⅱ型酮病奶牛血液炎性因子和Glu水平高于Ⅰ型酮病奶牛，说明Ⅱ型酮病奶牛的系统性炎症和糖脂代谢更加严重，也说明Ⅱ型酮病奶牛存在严重的IR，而这可能是Ⅱ型酮病更难治疗的潜在原因。

ALT和AST是衡量肝损害程度的特征性指标[20]。正常情况下，AST在血液中的含量较少，但是当肝细胞损伤严重时，AST的活性会升高并大量释放到血液中[21]。ALT主要贮存在肝细胞胞浆内，能够反映肝细胞的完整性。孙菲菲等[22]研究表明高浓度的NEFA、BHBA以及炎性因子会引起肝损伤；与此研究一致的是，酮病奶牛存在明显的肝损伤，且Ⅱ型酮病奶牛的肝损伤指标AST和ALT的活性也显著高于Ⅰ型酮病和健康奶牛，说明Ⅱ型酮病奶牛肝损伤更加严重，这可能是高浓度的NEFA和BHBA以及大量的促炎因子引起的。同时，肝损伤也会加重Ⅱ型酮病，增加治疗难度。

总之，酮病发生时机体存在系统性炎症和肝损伤，而且与Ⅰ型酮病相比，Ⅱ型酮病奶牛炎性反应和肝损伤更加严重。因此，了解酮病奶牛炎性因子和肝功能指标的变化情况，能够更好地区分不同类型的酮病，对不同类型的酮病进行针对性治疗提供依据。