鸡毒支原体TM-1蛋白嵌合新城疫病毒样颗粒的构建及鉴定

辛 梅，张 頔，李金斗，丁佳欣，于喜冰，徐小洪，丁 伟，邵亚男，单春辉，丁 壮

(吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春130062)

鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)属支原体科、支原体属，是介于细菌和病毒之间的一种病原体[1]。据流行病学调查显示，我国养殖场内鸡群的MG感染非常普遍[2-4]，MG感染后主要引起禽类的慢性呼吸道病(chronic respiratory disease，CRD)，呈慢性经过，造成产蛋率下降，饲料利用率降低，死亡率不高，但常与其他病原体如大肠杆菌、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)等混合感染，导致病情变得复杂、症状加重、死亡率升高。临床上雏鸡感染MG后，在接种新城疫(Newcastle disease，ND)弱毒活疫苗时，也会导致发病，造成ND抗体显著下降[5]。TM-1蛋白是由MG的VlhA5.02基因编码的一种保护性蛋白，具有高度的保守性[6]，对于MG感染后的黏附过程十分重要。SAITO等[7]证明TM-1免疫鸡群后，免疫保护率可达到80%，能够有效抵御MG感染，可以作为开发新型重组疫苗的候选抗原。

ND是由副黏病毒科、禽腮腺炎病毒属的NDV引起的急性、烈性、高度接触性的传染病[8]，具有高发病率和死亡率，是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》指出的优先防治的动物疫病之一[9]。目前，随着综合防控措施的不断加强，对于ND的防控取得了一定效果，ND流行得到了基本控制，但出现了新的流行病学特点即地方性、非典型性、免疫带毒以及免疫失败时有发生等[10]。

目前，养殖场鸡群MG感染普遍，与NDV混合感染后会导致鸡群症状加重，病情复杂，死亡率上升。而现存的针对MG的疫苗不能与ND疫苗同时使用，需要间隔一段时间，存在免疫窗口期，增加了鸡群患病的风险。因此研制安全有效、免疫程序简便的新型疫苗尤为重要。

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒蛋白组成的纳米级生物结构[11]。自1979年首次报道构建成功以来，各种病毒的VLPs不断被成功研制，VLPs已成为新型疫苗研发的有利平台。VLPs主要有以下几个优点：不含病毒核酸，无法感染与自我复制，具有良好的生物安全性；具有与病毒相似的结构与空间形态，可有效激发体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫；VLPs允许外源基因的插入，能够作为多功能的纳米载体将外源蛋白高效展示于表面，构成嵌合VLPs，为制备多价或多联疫苗提供可能。鉴于VLPs具有以上优点，本研究基于昆虫杆状病毒表达系统构建新型的MG TM-1蛋白嵌合NDV样颗粒，来补充现有疫苗的缺陷，以期为ND与MG感染的防控提供新方法。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及载体Sf9昆虫细胞，E.coliDH10Bac感受态细胞，rBv-M、rBv-HN、rBv-F以及pFastBac1空载体均为本实验室保存；E.coliDH5ɑ感受态细胞，pEASY-T Simple购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂M5HiPer Taq HiFi PCR mix购自北京聚合美生物技术有限公司；昆虫培养基Sf-900TMⅢ SFM (1X)购自Gibco公司；胎牛血清购自BI公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司；兔抗MG TM-1、兔抗NDV M、兔抗NDV F、兔抗NDV HN高免血清均由本室制备并保存；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent购自ROCHE公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计根据GenBank NDV HN(DQ659677.1)的胞外域序列、MG TM-1(NO-004829.2)的核酸序列，分别设计上、下游rHN-TM-1-F、rHN-TM-1-R鉴定引物以及M13、pFastBac1通用引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 相关引物信息

1.4 目的基因的合成根据GenBank MG TM-1(NO-004829.2)的ORF序列，依次添加柔性肽序列(G4S)与GenBank NDV HN(DQ659677.1)的胞外域序列连接，并在上游添加SalⅠ酶切位点，下游添加KpnⅠ酶切位点，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，命名为pUC-rHN TM-1。

1.5 表达rHN TM-1基因的重组穿梭质粒的构建及鉴定将pFastBac1空载体以及公司合成的pUC-rHN TM-1分别用SalⅠ、KpnⅠ进行双酶切，经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，胶回收其产物，连接、转化至E.coliDH5ɑ感受态细胞。次日，挑取单菌落进行PCR鉴定，取鉴定正确的菌株接种至LB液体培养基，过夜培养，提取质粒。利用特异性引物以及pFastBac1通用引物鉴定正确后，送至测序，将鉴定正确的重组穿梭质粒命名为pFastBac1-rHN TM-1。

1.6 表达rHN TM-1基因的重组杆粒的构建及鉴定将pFastBac1-rHN TM-1转化至E.coliDH10Bac感受态细胞，并进行3次蓝白斑筛选、PCR鉴定，获得阳性菌株。提取杆粒，将鉴定正确杆粒命名为rBacmid-rHN TM-1。

1.7 表达rHN TM-1基因的重组杆状病毒的拯救与鉴定当6孔板内Sf9细胞密度为70%～80%时将rBacmid-rHN TM-1与转染试剂按照1∶2的比例混合均匀，27℃培养96 h，收集上清，为P1代。将200 μL的P1代滴加入6孔板内细胞密度为70%～80%的Sf9细胞内，27℃培养96 h，收集上清为P2代，依次传至P4代。收集P4代杆状病毒，提取其基因组，分别用特异性引物及通用引物进行PCR鉴定，将结果正确的样品命名为rBv-rHN TM-1。

1.8 表达rHN TM-1基因的重组杆状病毒滴度的测定使用杆状病毒滴度快速测定试剂盒测定病毒滴度，具体操作见说明书。

1.9 IFA检测将rBv-M、rBv-HN、rBv-F、rBv-rHN TM-1以MOI=5共感染Sf9细胞，并分别设置未感染组作为对照，培养48 h后，用多聚甲醛溶液固定10 min，Triton通透10 min，分别以NDV M、NDV HN、NDV F、MG TM-1的多克隆抗体为一抗，FITC标记的猪抗兔IgG抗体为二抗，Hoechst染核处理，制备细胞爬片，然后利用激光共聚焦显微镜观察各组分蛋白表达情况。

1.10 MG-ND cVLPs的产生与鉴定

1.10.1MG-ND cVLPs的产生 Sf9细胞悬浮培养至密度为2×106，将构建成功的P4代rBv-rHN TM-1与实验室保存的rBv-M、rBv-HN、rBv-F以MOI=5共感染Sf9细胞，27℃、200 r/min培养96 h,收集细胞上清,分别经20%,30%,60%蔗糖密度梯度超速离心纯化获得cVLPs。

1.10.2MG-ND cVLPs的鉴定 将纯化后的cVLPs进行Western blot鉴定并利用透射电镜观察其形态特征。

2 结果

2.1 重组穿梭质粒pFastBac1-rHN TM-1的鉴定利用特异性引物以及pFastBac1通用引物对pFastBac1-rHN TM-1进行PCR鉴定，将产物经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果可见大小为987，1 112 bp的2条条带，与预期大小相符，送至测序结果无突变(图1)。

M.DL5000 DNA Marker；1.特异性引物PCR扩增rHN TM-1基因产物;2.通用引物PCR扩增rHN TM-1产物

2.2 重组杆粒rBacmid-HN-TM-1的鉴定经蓝白斑筛选3次后，三抗(Kan+Tet+GM)板所生长菌落均为白色，随机挑取白色菌落，接至液体三抗LB，过夜培养后提取杆粒，分别用特异性引物以及M13通用引物进行PCR扩增并将产物经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示，特异性引物PCR产物大小为987 bp，通用引物PCR产物大小约为3 187 bp(图2)。

2.3 重组杆状病毒rBV-rHN TM-1的鉴定

2.3.1Sf9细胞病变观察 将杆粒rBacmid-rHN TM-1转染至Sf9细胞，用光学显微镜观察发现，与正常Sf9细胞比较可见细胞生长缓慢，产生变大变圆、呈颗粒变性甚至脱落、破碎等典型病变(图3)。

M.DL5000 DNA Marker；1～4.特异性引物PCR扩增rBacmid-rHN TM-1产物；5～8.通用引物PCR扩增rBacmid-rHN TM-1产物

2.3.2重组杆状病毒rBv-rHN TM-1的鉴定 将杆粒rBacmid-rHN TM-1转染至Sf9细胞，依次传代，收集产生的杆状病毒，提取P4代杆状病毒的基因组，用特异性引物以及通用引物进行PCR鉴定，结果显示，条带大小与预期相符(图4)。

2.3.3IFA检测 利用激光共聚焦显微镜观察cVLPs的各组分蛋白表达情况，可见各试验组与对应未感染组相比均出现绿色荧光信号，表明各组分蛋白均正确表达(图5)。

A.正常Sf9细胞；B.rBv-rHN TM-1感染后细胞

M.DL5000 DNA Marker；1.特异性引物PCR扩增rBv-rHN TM-1产物；2.通用引物PCR rBv-rHN TM-1产物

图5 IFA检测蛋白表达

2.4 MG-ND cVLPs的鉴定

2.4.1MG-ND cVLPs的透射电镜观察 透射电镜观察纯化后的cVLPs形态，粒子呈球形，大小约为100 nm，表面存在纤突结构，与野生型NDV粒子相似(图6)。

2.4.2MG-ND cVLPs的Western blot分析 将经过纯化的MG-ND cVLPs进行Western blot 鉴定，结果显示可与NDV M、NDV HN、NDV F、MG TM-1的多克隆抗体结合且条带与预期的大小相符，其中NDV M因存在糖基化修饰，实际蛋白略大于40 kDa，NDV HN、NDV F 、rHN TM-1蛋白大小分别为70，55，35 kDa(图7)。

3 讨论

据流行病学调查显示，我国养殖场内鸡群MG的平均感染率高，致死率低[2-4]。雏鸡感染后抵抗力降低，常与呼吸道有关疾病并发，如ND、传染性支气管炎等，混合感染后会导致死亡率上升。ND是由NDV引起的烈性传染病，具有高发病率和死亡率。对于这两种疾病的最有效防控措施为疫苗接种，然而，广泛使用的传统MG和NDV疫苗均为弱毒疫苗，均存在明显不足。首先，NDV的弱毒苗主要为基因Ⅱ型的La Sota株，与我国目前流行的基因Ⅶ型NDV同源性仅为82%左右[12]，存在基因型不匹配的问题；第二，目前使用的MG活疫苗F36株，在免疫过程中必须与ND La Sota弱毒苗间隔使用，存在免疫窗口期，增加了鸡群患病的风险；第三，活病毒疫苗可能造成轻微的呼吸道或消化道症状[13]；第四，作为活疫苗，本身具有基因突变以及与流行的野生毒株发生基因重组的问题[14]，存在散毒和毒力返强的风险；第五，目前使用的活病毒疫苗以及灭活病毒疫苗，难以区分野毒感染与疫苗株感染，而野毒抗体与疫苗抗体的区别对于疫病防控的监测十分重要。因此，制备一种安全有效、免疫程序简便的ND-CRD疫苗刻不容缓。VLPs疫苗可以克服目前ND与MG疫苗使用的大部分问题。与活疫苗相比，VLPs不含病毒核酸，不能感染与自我复制，且排除了与野毒株重组的可能性，具有良好的生物安全性；与灭活疫苗相比，避免灭活疫苗灭活不彻底导致禽类个体发病的风险；与其他亚单位疫苗相比，VLPs作为外源性抗原可被抗原提呈细胞(APC)，特别是树突状细胞(DC)有效地摄取，然后由MHC Ⅱ类分子进行抗原处理和提呈，从而刺激CD4+T辅助细胞[15]。VLPs与天然病毒类似，也作为内源性抗原潜伏在DC细胞的胞浆中，并由MHC Ⅰ类分子呈现给细胞毒性CD8+T细胞(CTLs)[16]，这种交叉呈现机制确保了机体能够产生全面且有效的免疫反应；此外，VLPs平台也是适合应用于多种、多型的高突变RNA病毒[17-18]。NDV作为高突变率的RNA病毒，多种ND VLPs已被成功研制。在国内，钱晶等[19]证明了ND VLPs 可以有效诱导DC细胞的成熟。丁佳欣等[20]成功构建不同基因型的ND VLPs并证明了其具有良好的免疫原性以及免疫效果。此外，由于ND VLPs能够高密度展示表面蛋白以及释放率高等原因，在作为递送外源抗原的载体方面也显示出了巨大优势。在不影响自身合成的情况下，可以通过GPI锚定或胞外域替换等方式将外源蛋白如布鲁菌的BCSP31蛋白[21]，伯氏疏螺旋体的OspA、OspC蛋白[22]等展示于VLPs表面，经证明可以发挥较好的免疫原性以及有效抵御病原菌的攻击。

A.野生NDV NA-1株;B.MG-ND cVLPs

M.蛋白Marker；A.MG-ND cVLPs M蛋白；B.MG-ND cVLPs HN蛋白；C.MG-ND cVLPs F蛋白；D.MG-ND cVLPs rHN TM-1蛋白

本研究基于昆虫杆状病毒表达系统，以NDV基质蛋白为骨架，利用胞外域替换的方式，将NDV的HN蛋白胞外域替换为MG的TM-1蛋白，从而将TM-1蛋白嵌合至 ND VLPs表面，经激光共聚焦显微镜观察颗粒各组分蛋白均表达成功，蔗糖密度梯度离心纯化后，透射电镜观察可见大小约100 nm 的粒子，表面呈纤突结构，与野生型NDV大小一致；Western blot鉴定表达了NDV M、F、HN以及MG TM-1蛋白。因此，本研究成功构建了MG-ND cVLPs。虽然该cVLPs已成功制备，但其免疫原性以及免疫效果仍待进一步研究。综上所述，MG-ND cVLPs的构建为防控ND与MG提供了新的解决方案，可达到简化免疫流程、一针二防的目的，同时也为MG与其他病毒或细菌的混合感染提供了防控新思路。