冠突散囊菌对溃疡性结肠炎模型小鼠的保护作用及机制

景 悦，路晓杰，曹永国，张乃生

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因不明的慢性肠道炎症，在人类和动物中均存在一定的发病率[1]。UC表现为免疫异常，病程较长并伴发许多并发症，具有一定的癌变率甚至可诱发死亡[2]。目前UC患者可通过药物治疗控制病情，包括氨基水杨酸、糖皮质激素和免疫抑制剂等。这些药物虽可使病情得到缓解，但均会引起不同程度的副作用[3]。而且，有些患者无法获得持久的缓解，必须通过手术切除大部分甚至全部结肠，但手术治疗常会引起各种术后并发症；因此，当务之急是寻找新的可用于UC防治的疗法。

UC发病机制比较复杂，涉及遗传易感性，肠道上皮屏障缺陷，免疫失调和环境因素等[4]。据报道，巨噬细胞反应失调与UC的发生和发展高度相关，过表达的促炎因子增加了UC的发病率[5]。核因-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是调节炎症的重要途径，当IκB磷酸化时，下游的NF-κB信号通路可通过p65易位激活进入核内，从而改变相关炎症基因的表达。越来越多的研究表明，NF-κB参与了UC的发病机制，并且有针对性地抑制NF-κB可以减轻UC的预后[6]。而且，抑制NF-κB途径激活可降低促炎细胞因子水平[6]。因此，探索调节NF-κB的新治疗策略可能对UC治疗有广阔的前景。此外，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路也是主要的炎症途径，在调节细胞因子的分泌中起关键作用[7]。 从ZHANG等[8]的研究可知，MAPK信号通路在葡萄糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC小鼠中被显著激活。另外，肠道屏障是保护肠道健康的重要防线。结肠中紧密连接(tight junction,TJ)蛋白的结构异常是引发UC患者肠屏障破坏的重要因素之一[9]。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum,E.cristatum)是一种用于发酵茯砖茶的益生真菌，越来越多的研究表明，E.cristatum具备多种生物活性及药理价值，例如提高机体免疫力、降血脂、抗炎、抗肿瘤、调节肠道菌群等作用[10]。然而，关于E.cristatum对UC的作用及其潜在机制尚无明确信息。本试验采用DSS诱导的UC小鼠模型来探索E.cristatum对UC的治疗作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂DSS(MK 36 000～50 000 Da)购自MP Biomedicals公司；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)和白介素10(IL-10)ELISA试剂盒购自Biolegend公司；IκB，p65，p38，p-IκB，p-p65，p-p38，β-actin等一抗购自Cell Signaling TE.cristatumhnology 公司；HRP标记的二抗山羊抗兔抗体和山羊抗小鼠抗体购自Immunoway公司；TJ蛋白occludin一抗购自北京博奥森生物技术有限公司；即用型免疫组化超敏UItraSensitiveTMS-P检测试剂盒购自福建迈新生物技术公司。

1.2 制备E.cristatum挑取茯砖茶叶上黄色菌落置于生理盐水中，75℃水浴5～10 min后，倍比稀释，并在麦芽糖琼脂培养基上涂开，于30℃恒温条件培养3～5 d。挑取单菌落进行测序，经鉴定是E.cristatum后，-80℃保存备用。

1.3 实验动物及分组将40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(辽宁长生生物技术有限公司，中国辽宁)随机分为4组：对照(Control)组，Control/E.cristatum组、DSS 组，DSS/E.cristatum组(每笼5只小鼠，每组10只小鼠)。试验开始前，小鼠于(24±1)℃适应新环境1周。试验期间，Control组和Control/E.cristatum组小鼠每天自由饮水，DSS组和DSS/E.cristatum组小鼠每天饮用1.5% DSS，其中Control组和DSS组小鼠灌服无菌生理盐水(每只小鼠0.2 mL/d)，Control/E.cristatum和DSS/E.cristatum组小鼠灌服E.cristatum(每只小鼠3×107孢子/d)，每天记录体质量，并根据建立的评分系统评估疾病活动指数(DAI)，持续7 d。于试验结束后，处死所有小鼠，并收集相关样品用于后续分析。

1.4 组织病理学观察收集的结肠组织用10%中性福尔马林缓冲液固定，脱水，石蜡包埋，以 5 μm 的厚度切片后用苏木精和曙红(HE)进行染色，并在光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.5 炎性细胞因子测定将结肠组织在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(1∶9)中匀浆，并将混合物在4℃、12 000 r/min 离心15 min后，收集上清液并用于炎性细胞因子测定。按照ELISA试剂盒说明书方法测量TNF-α、IL-1β和IL-10的水平。

1.6 Western blot检测按照试剂盒说明书方法提取结肠组织中的总蛋白。将蛋白质样品在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，并转移到PVDF膜上，用30% BSA封闭，加入适当的一抗4℃过夜。次日，将蛋白膜与适当的二抗孵育，最后使用显影液进行显影。

1.7 免疫组织化学检测根据试剂盒说明书方法检测occludin蛋白。将每个载玻片与一抗occludin(1∶500)在4℃孵育过夜，用PBS洗涤，然后与HRP标记的山羊抗兔抗体孵育。然后，将每个切片用新制备的二氨基联苯胺染色，最后将玻片在苏木精中复染，并在氨水中返蓝后于显微镜下观察图像。

2 结果

2.1E.cristatum对DSS诱导小鼠结肠炎的缓解作用DAI评分是衡量UC严重程度的常用参数，是粪便黏稠和直肠出血的综合评分。Control组小鼠的体质量和DAI评分始终无显著性变化。与Control组小鼠相比，DSS组小鼠体质量明显减轻，DAI评分显著增加。但是，E.cristatum干预促使UC小鼠的上述指标发生了显著改善(图1A，B)。此外，与Control组相比，DSS组小鼠的结肠长度明显缩短，而E.cristatum明显改善了DSS造成的结肠缩短的情况(图1C，D)。与此同时，Control/E.cristatum组小鼠的各项指标相对于Control组没有明显变化，说明该剂量的E.cristatum对正常小鼠无副作用。

A.体质量变化；B.DAI评分；C，D.结肠长度

2.2E.cristatum对DSS诱导小鼠结肠炎结肠组织的保护作用病理组织学结果表明，Control组小鼠的结肠组织结构较为完整，肠上皮细胞的形态清晰可见。而DSS可引起急性炎症，其特征是杯状细胞大面积丢失，隐窝消失，炎性细胞浸润和上皮细胞破坏。与DSS组相比，DSS/E.cristatum组的黏膜损伤情况得到了缓解。这表明E.cristatum可以有效地改善UC小鼠的肠道病理组织学变化(图2A)。

TJ蛋白occludin是维持上皮细胞完整性和通透性的必不可少的机械屏障，其表达程度与结肠组织的健康程度密切相关。免疫组织化学结果表明，DSS组小鼠的结肠组织中occludin表达明显降低，而E.cristatum干预后可明显改善UC小鼠肠屏障的完整性(图2B)。

2.3E.cristatum对DSS诱导小鼠结肠炎炎性因子的调节作用为了探讨E.cristatum对炎性细胞因子水平的影响，本试验检测了结肠组织中促炎细胞因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎细胞因子(IL-10)的表达。结果表明，与对照组相比，DSS组小鼠的结肠组织中TNF-α和IL-1β水平显著升高，而IL-10水平上显著降低。E.cristatum干预后，UC小鼠的3种炎症细胞因子的分泌水平均得到了显著性改善(图3A～C)。

A.组织病理学变化；B.肠屏障的完整性

*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.4E.cristatum对DSS诱导小鼠结肠炎炎症通路的影响已有研究证实了NF-κB信号途径和MAPK信号途径与肠道内炎症的发病机理密切相关[11-12]。磷酸化p65、IκB蛋白代表NF-κB信号途径的激活状态，磷酸化p38代表MAPK的激活状态。结果显示，与Control组小鼠相比，DSS组小鼠的结肠组织中磷酸化p65、IκB和p38的表达显著上调，E.cristatum干预显著抑制了UC小鼠结肠组织中磷酸化p65、Iκ-B和p38的水平(图4)；表明E.cristatum可以通过抑制NF-κB和MAPK信号传导的激活发挥抗炎作用。

图4 Western blot检测p65、p-p65、IκB、p-IκB、p38和p-p38的蛋白表达(A，C)及量化分析(B，D)

3 讨论

UC是一种病因不明，对直肠和结肠有害的疾病。近年来，UC的发病率和患病率在全球范围内逐年增加，但其病因和发病机制尚未完全阐明。AHMED等[13]研究认为UC主要与遗传、感染、环境和免疫有关。UC的药物治疗主要基于氨基水杨酸、激素和免疫抑制剂，虽然可以控制UC症状，但肝毒性、激素抵抗性、副作用等问题难以解决。因此,更为合理及有效的替代治疗法仍然有待发现。近年来，多种天然食物成分被发掘于治疗UC。橙皮苷可通过降低结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量来下调血清中IL-6的水平[14]。大蒜素能调节CD68、MPO、MDA和炎症因子表达，从而改善DSS诱导的UC[15]。GAO等[16]发现绿原酸通过抑制MAPK / ERK / JNK信号通路在UC的治疗中发挥作用。E.cristatum是存在于茯砖茶中的优势真菌，对茯砖茶的颜色和风味起着重要作用，E.cristatum与金黄色葡萄球菌混合发酵的次级代谢产物对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性[17]。KANG等[18]研究发现E.cristatum可通过调节肠道菌群改善肥胖。E.cristatum具有多种生物活性及药用价值，但目前尚未有其改善UC的作用的报道；因此本试验以DSS诱导的小鼠作为UC动物模型探究E.cristatum对UC的保护作用及相关机制。

DAI评分是评估UC严重程度的主要参数[19]。在DSS组小鼠中，DAI分数显著增加，但是，E.cristatum明显改善了DSS处理小鼠的DAI评分。此外，E.cristatum还改善了DSS引起的结肠缩短。本试验从病理组织学分析发现，DSS处理可导致隐窝和杯状细胞明显丢失，但是，E.cristatum显著改善了这些变化，表明E.cristatum对DSS诱导的UC具有保护作用。而且，Control/E.cristatum组的各项指标相对于Control组没有明显变化，表明在试验剂量下，E.cristatum对机体没有副作用。

研究表明，UC的发病机理与炎症环境息息相关。UC患者的肠道上皮细胞会沉浸在慢性炎症细胞因子环境中，同时会产生过量的促炎细胞因子[20]。在本试验中，DSS可显著升高结肠组织中TNF-α和IL-1β的水平，而E.cristatum干预后显著下调了UC小鼠结肠组织中的这些促炎细胞因子。作为多效抗炎细胞因子，大多数造血细胞均可产生IL-10[21]。本试验结果表明，E.cristatum干预可提高UC小鼠结肠中IL-10的水平。

UC是一种免疫相关疾病，NF-κB是调节固有免疫反应和炎症的关键转录因子。激活的NF-κB通过参与调节结肠和直肠黏膜中免疫细胞的浸润，达到抑制UC的作用。NF-κB的激活主要是通过其抑制剂IκB的磷酸化和解离来实现的，在DSS诱导的结肠炎模型中，IκB和p65的磷酸化水平明显增加[22]。本试验结果显示，E.cristatum可以降低IκB和p65蛋白的磷酸化水平，从而抑制NF-κB的活性。MAPK是一种高度保守的丝氨酸蛋白酶，参与介导细胞分化、增殖、分裂和凋亡的过程，MAPK途径与肠道损伤有关[23]。在MAPK中，p38被认为是主要激酶，可以被多种细胞因子、激素和蛋白质诱导[24]。近年来，人们越来越意识到MAPK/p38信号通路在UC的发病机制中的重要作用[25]。本试验发现E.cristatum可以改善UC小鼠的MAPK 信号通路中p-p38蛋白的表达，结果表明，E.cristatum可通过抑制NF-κB和MAPK分子途径的激活发挥出色的抗炎功能。

肠道上皮细胞的TJ是维持细胞完整性和通透性的必不可少的机械屏障。据报道，UC患者的TJ蛋白如occludin的表达量明显降低[26]。因此，调节TJ蛋白对于治疗UC至关重要。本试验通过免疫组织化学分析了occludin的表达，结果表明，E.cristatum处理抑制了DSS诱导的occludin表达水平下降，表明E.cristatum可能在维持occludin表达中起着至关重要的作用，从而平衡了屏障的完整性并减轻了对结肠的损害。

综上所述，E.cristatum可明显地降低UC的严重程度，修复受损的结肠组织及肠道屏障，调节炎性因子，具有一定的抗炎效应，且这一效应很有可能是通过调控 NF-κB 信号通路和 MAPK 信号通路的激活来实现的。因此，E.cristatum可能是防治UC的一种新的天然产物，这对人类与动物的UC在临床上的治疗与推广具有一定的指导意义。