菟丝子水提物对子宫内双酚A暴露小鼠的生殖保护作用

李淑颖，耿玉萌，崔宇擎，卢春雨，史万玉,2*，包永占,2*

(1.河北农业大学 中兽医学院，河北 保定 071000；2.河北省中兽药工程技术研究中心，河北 保定 071000)

双酚A(bisphenol A，BPA)，2，2-二(4-羟基苯基)丙烷，是一种典型的内分泌干扰化合物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)[1]。分子式为C15H16O2，其单体可直接通过酯键聚合。酯键可以被酸、碱水解而释放单体[2]，进入机体可具有雌激素活性及抗雄激素活性，会干扰机体正常的内分泌功能，影响生殖系统及子代生长发育[3]。BPA从1992年开始被生产，广泛用于生产生活中，例如超市、银行柜台的机打购物票据中[4]、一次性纸杯的内涂层[5]、啤酒易拉罐[6]等。由于日常生活中的大量应用，大气颗粒[7]甚至在土壤[8]中都检测到BPA的存在。这样就会使BPA通过饮水、饮食、呼吸等途径进入到人体产生富集，对机体造成一定程度的损伤。在现有的研究中已经证明暴露BPA对子代雌鼠具有生殖损伤[9]，BPA也可以直接作用于下丘脑-垂体-卵巢轴(HPOA)，还可以间接地通过雌激素受体、表观遗传学、类固醇激素相关酶的表达及其活性调节改变HPOA的生理效应[10]。大量研究表明BPA不仅可以影响生殖器官的形态和功能还可以抑制胎儿的早期发育，从而增加妊娠母体的流产率，并产生多种生殖毒性[11]。

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子(CuscutaaustralisR.Br.) 或菟丝子(CuscutachinensisLam.) 的干燥成熟种子，始载于《神农本草经》中被列为上品[12]。古代医者用菟丝子配伍不同中药治疗腰膝酸软等肾虚病证及生殖系统疾病[13]。现代研究也证明菟丝子具有保肝补肾[14]、调节生殖内分泌、改善生殖损伤[15]等多种作用。目前，对BPA造成的生殖损伤的缓解作用研究多集中在药物的单体成分[16-17]，而鲜有研究涉及药物水提物对BPA的生殖损伤的缓解作用。本试验将针对孕期暴露BPA的孕鼠所产的子代雌性小鼠进行试验，主要研究菟丝子水提物缓解BPA所导致子代雌性小鼠的损伤作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂BPA(分析纯≥99%,Sigma,USA)；NaOH(分析纯≥96%，天津市恒兴化学试剂制造有限公司)；无水乙醇(分析纯≥99.7%,天津市富宇精细化工有限公司)；Go Taq®PCR Master Mix(A6001 Promega,USA)；GoScriptTMReverse Transcription System(A5001,Promega,USA)；Eastep®Super总 RNA提取试剂盒(LS1040,Promega,北京)；小鼠雌激素受体α(ERα) ELISA Kit、小鼠雌二醇(E2) ELISA Kit、小鼠孕酮(P4) ELISA Kit、小鼠BPA ELISA Kit(上海酶联生物科技有限公司)。

1.2 试验仪器防漏水瓶(苏杭科技器材有限公司，苏州)；MDF-383E超低温冷冻箱(日本SANYO Electric Biomedical公司，日本)；T10BS25组织匀浆机(IKA公司，美国)；LightCycler®96全自动荧光定量PCR仪(罗氏诊断产品有限公司，上海)；SQP 电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司，北京)；Multiskan Ascent酶标仪(Thermo，USA)。

1.3 实验动物分组及处理8周龄昆明小鼠75只购自斯贝福(北京)生物科技有限公司，SPF级别，许可证号：SCXK(京2019-0010)，其中雄鼠25只，雌鼠50只。适应性饲养1周，每日给予光照、黑暗各12 h，饲养环境温度保持在(25±0.5)℃，湿度50%～60%，自由采食和饮水。1周后于20：00以后合笼，第2天9：00前检查阴栓，发现阴栓的当天定为怀孕的第1天。本试验将50只怀孕母鼠均分为5组每组10只，分别为空白对照组(K组),模型对照组(M组),菟丝子水提物0.7(D组),1.4(Z组),2.8 g/kg(G组)剂量组。雌性小鼠从怀孕的当天早上检查确认怀孕后开始分笼，1只/笼。K、M、D、Z、G各组每天分别灌服不同剂量的(0.0，0.0，0.7，1.4，2.8 g/kg)菟丝子水提物0.3 mL/只，其中K、M组灌胃0.9% 生理盐水0.3 mL/只，M、D、Z、G组均按照5 mg/kg 的剂量饮用含BPA的水。待小鼠21日龄断乳当天进行取样。本试验中实验动物的使用经河北省动物保护协会批准，动物处理过程通过实验动物管理和使用委员会的动物伦理学审查。

表1 实验动物处理方式

1.4 菟丝子水提液的制备菟丝子先后依次经过清洗、浸泡、煎煮、过滤、浓缩等程序提取药液。称取50 g菟丝子，清洗后用40倍的水即2 000 mL浸泡2 h。先用600 mL浸出液武火煮沸后改文火2 h(判定标准是水不能没过纱布包即关火)，纱布过滤出上清约为200 mL。再重复3次以上操作，保证菟丝子的熬制时间要大于6 h[18]。将3次所得药液微火熬制250 mL，放入水浴中90℃[19]浓缩至50 mL，即每 1 mL 药液相当于1 g 生药量。菟丝子在人类临床用量为6～12 g[12]，按照9 g计算，人与小鼠的换算系数为9.1，菟丝子3组给药剂量分别为0.7,1.4,2.8 g/kg。

1.5 指标测定

1.5.1生产指标 在子代小鼠出生之前记录孕期时长(d)、孕期增重(g)；子代小鼠出生后，记录产子总数(个)、出生窝重(g)、出生均重(g)、死胎数(个)；处死之前记录体质量及雌雄比(雌鼠只数/雄鼠只数×100%)。

1.5.2子代断乳雌鼠脏器系数计算方法 小鼠测体质量，眼球采血后脱颈处死，取出卵巢除去多余脂肪后，用分析天平测质量。

卵巢系数=卵巢质量(mg)/体质量(g)×100%。

1.5.3子代断乳雌鼠血清中激素的测定 小鼠测体质量后，眼球摘除采血，血液经3 500 r/min离心10 min，离心后收集血清，按照购自上海酶联生物科技有限公司的E2、P4、BPA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪检测D值。

1.5.4子代断乳雌鼠卵巢中ER含量测定 将100 mg 卵巢组织匀浆成1 mL含0.9%生理盐水的混悬液，3 500 r/min离心15 min，离心后吸取上清液，按照购自上海酶联生物科技有限公司的ERα试剂盒说明书进行操作，酶标仪检测样品D450 nm值。

1.5.5子代断乳雌鼠卵巢中DNA甲基转移酶3a(Dnmt3a)、DNA甲基转移酶3b(Dnmt3b)、ERα及孕酮受体(PR) mRNA的表达水平 使用总RNA提取试剂盒提取卵巢总RNA。通过RNA质量鉴定D260 nm/D280 nm值为1.9～2.1，D260 nm/D230 nm值为2.0～2.5，以证明RNA未被DNA、蛋白质及有机试剂污染，也没有发生大量降解。随后用反转录试剂盒合成cDNA。以GAPDH作为内参基因，用RT-qPCR法对Dnmt3a、Dnmt3b、ERα及PR基因转录水平进行检测，引物由TaKaRa(大连，中国)设计并合成(表2)。使用LightCycler®96全自动荧光定量PCR仪设置程序：预变性95℃ 30 s；95℃ 5 s,64℃ 30 s,72℃ 30 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算各目的基因相对转录水平。

表2 引物信息

2 结果

2.1 孕期增重由图1可以看出，前15 d各组孕鼠的增重没有显著变化(P>0.05)，但是与K组相比M组孕期总增重显著降低(P<0.05)。与M组相比，1.4，2.8 g/kg菟丝子水提液可使孕期总增重显著增加(P<0.05)。

2.2 孕期、产子总数、出生窝重、出生均重、死胎数、雌雄比由表3可以看出，与K组相比，M组母鼠所生后代的死胎数显著升高(P<0.05)，而Z组与M组相比死胎数显著降低(P<0.05)。Z组与M组相比表现为雌雄比显著降低(P<0.05)，其余4个指标无显著性差异(P>0.05)。

与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比，# P<0.05，## P<0.01。下同

表3 BPA暴露对妊娠母鼠生产指标的影响

2.3 BPA暴露对卵巢系数的影响由表4可以看出，在21日龄断乳时空白组、模型组、菟丝子水提液组各组织间卵巢系数均无显著性差异。

表4 BPA暴露对卵巢系数的影响

2.4 妊娠期暴露BPA对子代断乳雌鼠血清BPA、E2、P4水平的影响从图2可以看出与K组相比，M、D、G组BPA水平均表现为显著升高(P<0.05)，而Z组与K组之间无显著性差异(P>0.05)，说明孕鼠暴露BPA对子代雌鼠血清中BPA水平是有遗传性影响的，并且1.4 g/kg菟丝子水提液可以降低雌仔鼠血清中BPA含量。

图2 妊娠期暴露BPA对子代断乳雌鼠血清BPA、E2、P4水平的影响

与K组相比，M组和G组E2水平均表现为显著降低(P<0.05)；与M组相比，Z组血清中的E2水平表现为极显著升高(P<0.01)。

与K组和M组相比，Z组均表现为P4水平显著升高(P<0.05)，D 和G组与K、M组均无显著性差异，说明1.4 g/kg菟丝子水提液可以更好地提高孕激素水平。

2.5 妊娠期暴露BPA对子代断乳小鼠卵巢中ERα含量的影响由图3可以看出，与K组相比，G组卵巢的组织匀浆中ERα极显著升高(P<0.01)；与M组相比,G组ERα表现为极显著升高(P<0.01)；M组与K组相比表现出ERα降低的趋势但是无显著性差异(P>0.05)。

图3 妊娠期暴露BPA对子代断乳小鼠卵巢中ERα水平的影响

2.6 孕期暴露BPA对子代断乳雌鼠卵巢中Dnmt3a、Dnmt3b、ERα、PR mRNA转录水平的影响从图4可以看出,在21日龄断乳时，与K组相比，M、Z、G组雌鼠的Dnmt3a mRNA转录水平显著降低(P<0.05)；与M组相比，D组表现为显著升高(P<0.05)。而21日龄雌鼠的Dnmt3b mRNA转录水平无显著性差异(P>0.05)。

图4 妊娠期暴露BPA对子代断乳雌鼠Dnmt3a、Dnmt3b mRNA转录水平的影响

从图5可以看出，在21日龄断乳时，与K组相比D组雌鼠的ERα mRNA水平显著升高(P<0.05)，与M组相比也显著升高(P<0.05)。21 d雌鼠的PR mRNA水平无显著性差异(P>0.05)。

图5 妊娠期暴露BPA对子代断乳雌鼠ERα、PR mRNA转录水平的影响

3 讨论

BPA暴露的方式包括玉米油灌胃[22]、腹腔注射[23]、饮水给药[24]等多种，饮水给药因对孕鼠刺激较小而广泛采用。近年来多项研究表明BPA无明显副作用剂量(no-observed-adverse-effect-level，NOAEL)远远小于美国食品药品管理局(food and drug administration，FDA)所规定的50 mg/(kg·d)[25-26]。妊娠期和新生儿期是BPA暴露最为敏感时期，在发育的各个阶段以低于暴露极限安全范围(lowest-observed-effectlevel,LOAEL)或者认为是安全剂量暴露于BPA的时候也会产生多种不良反应[27]。

本研究显示孕期暴露BPA可以显著降低孕鼠怀孕期间的总增重，所产仔代死胎率增加，这与WANG等[28]的研究结果一致；说明BPA确实可以造成胚胎的发育不良。而1.4，2.8 g/kg菟丝子水提液可以改善由于BPA暴露造成的对胚胎增重所造成的不良影响。1.4 g/kg菟丝子水提物可显著缓解BPA造成的死胎增多的现象，说明菟丝子水提物对BPA导致的胚胎发育不良有缓解作用。此外，本试验结果表明BPA不会改变性别比与产子数，这一结果与SOMM等[29]的研究一致。在21日龄时没有发现卵巢系数的显著性差异(P>0.05)，可能与卵巢的质量太轻误差较大，或是统计数量不够不足以看到差异有关。

本试验检测仔鼠血清中BPA的残留量发现，21日龄时与空白对照组相比，模型组、0.7和2.8 g/kg菟丝子水提液剂量组均表现为BPA显著增高(P<0.05)，而1.4 g/kg菟丝子水提物剂量组与空白组之间没有显著性差异(P>0.05)，说明孕鼠暴露BPA对子代雌鼠血清中BPA水平是有遗传性的[30]， 1.4 g/kg 菟丝子水提物剂量组可以降低子雌鼠血清中BPA含量,因此，推测1.4 g/kg菟丝子水提物能较好缓解BPA对仔鼠的损伤作用可能与其显著降低仔鼠体内BPA残留有关。机体的激素水平在一定范围内维持平衡，E2和P4变化能反映机体生殖内分泌的功能，母鼠暴露BPA可导致子一代小鼠E2和P4水平极显著降低[31]。但是对于雌性小鼠来说1.4 g/kg菟丝子水提液可提高E2、P4水平。分析M组与G组均表现为E2水平的显著降低，但是原因应该不同，模型组是由于BPA的弱雌激素效应，抑制小鼠体内E2的正常产生，所以检测到E2水平降低。2.8 g/kg菟丝子水提液剂量组可导致E2水平的持续升高从而引发机体自我调节作用所造成的E2的下降。对于雄性小鼠来说0.7，2.8 g/kg剂量的菟丝子水提液可以导致E2水平异常升高的现象，分析可能是由于BPA在体内残留所致，BPA在体内与E2竞争ERα导致机体产生E2增加。

ERα能以二聚体的形式与E2结合，启动雌激素应答元件转录，从而发挥雌激素效应[32]，对于雌性小鼠的卵巢发育以及生殖起着重要的作用。由于BPA的弱雌激素效应，抑制小鼠体内E2的正常产生，正常产出的E2减少从而导致模型组的ERα水平呈下降趋势。虽然2.8 g/kg的菟丝子水提液也表现为E2激素减少，但同时菟丝子也可以刺激机体产生大量的ERα反过来刺激机体E2的回升。

DNA甲基化在DNA甲基转移酶(Dnmt)催化下发生并维持[33]，Dnmt3a和 Dnmt3b参与从头合成甲基化过程[34]，对基因调控、突变、基因组印迹和细胞生长、发育、分化等方面都有重要影响。DNA甲基转移酶的降低不利于成熟配子对印迹基因的维持，可能导致多种发育疾病发生[35]。对于21日龄的雌性小鼠来说模型组的Dnmt3a mRNA 水平表现为显著降低，这与魏媛媛等[9]的研究一致，确定BPA会对子代小鼠造成不良影响，0.7 g/kg的菟丝子水提液可以显著升高Dnmt3a mRNA水平，说明其对于BPA造成的损伤可起到缓解作用。

对于雌性小鼠来说0.7 g/kg的菟丝子水提液组的ERα mRNA水平显著升高(P<0.05)，PR mRNA水平也表现出升高的趋势(P>0.05)，但1.4，2.8 g/kg 的菟丝子水提液剂量组却并不能看出明显的改变，ERα、PR mRNA水平与菟丝子提取液剂量之间存在非线性关系，其原理有待进一步研究分析。

本研究结果表明，妊娠期暴露BPA能显著扰乱子代21日龄断乳雌鼠生殖激素的活性与含量；扰乱生殖激素受体水平，扰乱DNA甲基转移酶的基因表达；仔鼠血清中BPA水平、DNMT基因水平说明BPA可通过母体遗传给下一代，并具有一定生殖毒性。综合来说使用1.4 g/kg的菟丝子水提液可在一定程度上改善这种紊乱现象，但是也有一些由于菟丝子水提液引起的检测指标异常的现象，其原因有待进一步分析研究。