埃里希氏体病和莱姆病双重荧光定量PCR诊断方法的建立

常 瑾，高 超，于喜冰，李俊娇，穆佳琦，柴浩然，成姗育，尹仁福

(吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062)

蜱虫是专性吸血的体外寄生虫，是仅次于蚊子的第二大媒介，可传播细菌、病毒和原生动物等，对公共卫生和畜牧业发展造成严重危害。新兴细菌感染性疾病中的很大一部分是由蜱虫等人畜共患病媒介传播的。这些疾病中最突出的是莱姆病、埃里希体病和巴尔通体病[1]。

伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi, B.g)是引起莱姆病的病原体。莱姆病(Lyme disease,LD)是一种机体多系统多器官炎症性反应的人兽共患病[2]，现已广泛分布于欧洲、亚洲，是美国最常见的蜱虫传播疾病，具有分布广、传播快、致残率高的特点[3]。1986年在黑龙江省林海县首次分离到伯氏疏螺旋体，证明了我国存在伯氏疏螺旋体。目前已证实我国30多个省(自治区、直辖市)存在伯氏疏螺旋体感染，20个省、市、自治区存在自然疫源地[4]。

无形体科埃里希氏体属的成员在人类和动物中引发埃里希氏体病[5]。埃里希氏体是一种专性的胞内寄生菌，除野生动物宿主外，家畜、伴侣动物和人类也均为其易感宿主[6]。自1935年在阿尔及利亚发现第1株埃里希氏体后[7]各地不断出现埃里希氏体病例，目前已有研究人员在我国犬、鼠、羊、蜱及人体内检测到埃里希氏体核酸及抗体[8]，显示我国可能存在该病的自然疫源地。

随着经济水平的提高，人与自然接触逐渐增多，以蜱虫为媒介的传染病如莱姆病和埃里希氏体病的诊断与防控已引起人们的关注。目前主要通过将血细胞进行吉姆萨染色，镜下观察是否存在桑葚体来确诊埃里希氏体病，而莱姆病的诊断虽有现行有效的国家标准，但其推荐的病原分离及血清学检测操作难度大，周期长，对操作人员要求较高，且目前缺少同时诊断这两种疾病的方法及标准，而聚合酶链式反应(PCR)由于特异性好，操作简单成为一种广泛应用的实验室检测方法[9]。因此建立一种同时诊断莱姆病及埃里希体病的分子生物学诊断方法成为亟待解决的问题，也可为国家标准的制定提供理论基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体伯氏疏螺旋体B31标准菌株、埃里希氏体、钩端螺旋体、立克次体、大肠杆菌、绿脓杆菌基因组样品由本实验室保存；蜱虫样品于2018年采集自黑龙江省佳木斯市牛体表；pGEM®-T Easy 载体系统购自普洛麦格生物技术有限公司。

1.2 主要试剂Wizard®Genomic DNA Purification Kit购自普洛麦格生物技术有限公司；DH5α感受态细胞由本实验室保存；凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen公司；PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)、DL2000 DNA Marker等试剂购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂为国产或进口分析纯。

1.3 引物合成扩增埃里希氏体groEL基因保守区域及伯氏疏螺旋体ospA基因全长，并选取上述基因保守序列设计荧光定量PCR引物，根据蜱细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(cytochrome coxidase subunit Ⅰ,Cox Ⅰ)设计蜱种鉴定引物[10],详见表1。引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 阳性标准质粒构建参照Wizard®Genomic DNA Purification Kit说明书提取纯化伯氏疏螺旋体基因组，通过普通PCR方法扩增埃里希氏体基因组样品中热休克蛋白groEL保守区域(使用Ehr-groel-F和Ehr-groel-R引物，反应程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，40个循环;72℃ 10 min)及伯氏疏螺旋体表面A蛋白ospA全长(使用ospA F和ospA R引物，反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 10 min)。反应体系：上、下游引物各2 μL；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye) 15 μL；ddH2O 7 μL；模板4 μL。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，凝胶回收，连接至pGEM®-T Easy载体并转化到E.coliDH5α感受态细胞中，提取重组质粒，使用T载体通用M13引物通过PCR方法鉴定，将鉴定阳性质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。经序列比对后，将阳性质粒分别命名为pT-groEL及pT-ospA。

1.5 反应条件优化通过普通PCR方法优化退火温度，依据引物Tm值±5℃范围内每2℃设置1个温度梯度，并用矩阵法优化引物浓度：0.2～1.0 μmol/L，每0.2 μmol/L设置1个梯度。

1.6 荧光定量PCR标准曲线建立测定阳性标准质粒pT-groEL及pT-ospA浓度，依据拷贝数计算公式，将标准质粒稀释为1×1010拷贝/μL。用Nuclease-Free Water将阳性标准质粒10倍梯度稀释为1×1010～1×101拷贝/μL。运用上述反应体系及条件，进行单引物单模板荧光定量PCR，每组重复3次，输出标准曲线。

1.7 熔解曲线分析将通过最优反应条件扩增获得熔解曲线双峰的Tm值，与单引物单模板荧光定量特异性熔解曲线单峰相比较，验证Tm值吻合程度。

1.8 特异性检验运用上述方法对钩端螺旋体、立克次体、大肠杆菌、绿脓杆菌基因组进行检测，评价其特异性。

1.9 重复性检验随机选取3个等浓度的pT-groEL和pT-ospA标准质粒为模板，使用上述荧光定量PCR方法连续扩增3次，通过对Ct值、Tm值等数据进行分析，验证方法的稳定性。

1.10 敏感性检验以梯度稀释后的pT-groEL及pT-ospA标准质粒为模板，使用上述方法进行双重荧光定量PCR扩增，利用荧光定量PCR仪不能检出荧光信号时的稀释浓度和Ct值，推算本方法所能检出的敏感性下限。

1.11 临床样品检测及符合度评价将采集自黑龙江省佳木斯市的蜱虫样品，依据形态学差异分类，70%酒精清洗3次，用研钵将液氮冷冻后的蜱虫组织磨碎，参照Wizard®Genomic DNA Purification Kit说明书对蜱虫样品全基因组DNA进行提取和纯化。使用蜱种鉴定引物Cox Ⅰ扩增(反应程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 10 min，反应体系同1.4)后经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，经Blast比对后，确定蜱虫种类。使用本研究建立的方法对可能携带埃里希氏体和伯氏疏螺旋体的蜱基因组样品进行检测。

将上述基因组DNA作为模板运用埃里希氏体dsb基因[11]及伯氏疏螺旋体的5S～23S间隔序列[12]引物通过普通PCR方法进行验证，经琼脂糖凝胶电泳后测序，测序结果用Blast比对。

2 结果

2.1 阳性标准质粒构建成功构建阳性标准质粒pT-groEL及pT-ospA，通过目的基因特异性扩增及载体通用引物鉴定与预期大小一致(图1)，且测序结果正确。

M.DL2000 DNA Marker；1.特异性引物扩增；2.M13通用引物扩增

2.2 反应条件优化依据反应条件优化结果，确定双重PCR反应的最优反应程序：94℃ 30 s，94℃ 5 s，50℃ 15 s，72℃ 45 s，40个循环；最佳反应体系:PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 10 μL，Nuclease free Water 4.5 μL，上、下游引物分别为groEL 0.75 μmol/L，ospA 1 μmol/L，2种阳性标准质粒各1 μL。以DEPC水为模板设置阴性对照。

2.3 标准曲线建立每个稀释梯度的重复样品Ct值相同，随着标准品稀释程度的增加，Ct值逐渐增大。并根据标准质粒浓度与Ct值建立相关性，分别建立标准曲线的相关系数(R2)，具有较好的线性相关性，其中埃里希氏体标准曲线：y=-3.108 5x+37.99，R2=0.983 3(图2)，伯氏疏螺旋体标准曲线：y=-3.114 2x+35.367，R2=0.993 1(图3)。通过对拷贝数x与Ct值之间的线性关系进行推算，可对检测样品进行定量。

1～10.标准质粒浓度为1×1010～1×101拷贝/μL；11.阴性对照

2.4 熔解曲线分析本研究所建立的方法在1条平滑的熔解曲线上产生了2个特异性的峰值，分别对应埃里希氏体和伯氏疏螺旋体的Tm值，与单引物荧光定量产生的熔解曲线Tm值相吻合(图4)。结果判断：实时荧光定量PCR反应结束后，观察熔解曲线峰值(Tm值)分析试验结果：若检测样品出现阳性扩增信号且在Tm=(78.12±0.40)℃出现单一的特异性峰判为埃里希氏体阳性；若检测样品出现阳性扩增信号且在Tm=(80.2±0.14)℃出现单一的特异性峰判为伯氏疏螺旋体阳性；若Tm=(76.61±0.34)℃和Tm=(80.2±0.14)℃均出现峰值，表明埃里希氏体和伯氏疏螺旋体混合感染。

2.5 特异性检验运用本研究所建立双重荧光定量PCR方法对埃里希氏、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、立克次体、大肠杆菌、绿脓杆菌基因组进行检测，仅试验组埃里希氏体及伯氏疏螺旋体出现特异性扩增，其他组均无交叉反应(图5)。

1～10.标准质粒浓度为1×1010～1×101拷贝/μL；11.阴性对照

1.埃里希氏体单引物扩增；2.伯氏疏螺旋体单引物扩增；3.双重荧光定量PCR扩增；4.阴性对照

图5 埃里希氏体和伯氏疏螺旋体双重荧光定量PCR特异性检验

2.6 重复性检验本研究所建立的方法输出熔解曲线重合度较高，对应Tm值较为稳定，标准差均小于0.1，变异系数(CV)均小于0.1%(表2)；说明本方法扩增重复性好，有良好的稳定性。

表2 双重荧光定量PCR的不同浓度重复性分析

2.7 敏感性检验用本研究建立的埃里希氏体和伯氏疏螺旋体双重荧光定量PCR检测方法对梯度倍比稀释的标准质粒进行检测，得出该方法对埃里希氏体及伯氏疏螺旋体的检测下限均为1×101拷贝/μL(图6) 。

1～10.标准质粒浓度为1×1010～1×101拷贝/μL；11.阴性对照

2.8 临床样品检测及符合度评价经形态学分类及PCR鉴定(图7)，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段与预期大小一致，获得序列经比对确定蜱虫种类均为全沟硬蜱。分别使用普通PCR和双重荧光定量PCR检测方法，对25份全沟硬蜱基因组DNA样品进行检测(图8，9)，检测结果见表3，其中阳性样品Ct值为11.08～20.49，本研究建立的方法中埃里希氏体检出率为28%，伯氏疏螺旋体检出率为60%，与普通PCR方法样品检出率高12%。

表3 临床样品检测结果 份

3 讨论

埃里希氏体病检测的金标准间接免疫荧光(IFA)是最早用于埃里希氏体病检测的实验室诊断方法，但该病原培养周期长、需要特殊细胞系，培养难度高，且与该属其他病原存在交叉反应，易出现假阳性结果，临床上并不常用。莱姆病的临床表现复杂多样，传统的实验室检测主要包括病原和血清学检查。病原菌检测由于病原体分离率低，生长缓慢，操作周期长，难以及时准确的诊断，血清学检测抗体间可能出现交叉反应，具有一定的不准确性，并且无法判断特异性抗体是持续出现还是反复出现[13]。

多重荧光PCR方法具有检测效率高，即多重荧光PCR可以实现一管多检，简化操作流程，节省试剂成本和操作时间，尤其是在开展大量样品检测时，显著地降低检测成本和操作时间等优势。本研究选用性价比较高的SYBR Green Ⅰ染料法荧光定量PCR，利用SYBR Green 染料的荧光信号强度与双链DNA的数量之间的线性关系，对PCR体系存在的双链DNA数量进行监测并利用熔解曲线为鉴别诊断提供了理论和技术支撑[14]。熔解曲线是反映DNA的双螺旋结构随温度升高产生降解程度的曲

A.蜱虫样品背侧观；B.蜱虫样品腹侧观；C.部分蜱虫样品CoxⅠ基因鉴定结果；M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～5.部分蜱虫样品扩增结果

A.埃里希氏体阳性样品dsb基因鉴定结果(M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～6.埃里希氏体阳性样品)；B.伯氏疏螺旋体5S～23S间隔序列鉴定结果(M.DL2000 DNA Marker；1～10.部分伯氏疏螺旋体阳性样品；11.阴性对照)

图9 部分阳性样品双重荧光定量PCR检测结果

线，其总的DNA双螺旋结构降解一半时的熔解温度称为Tm值，Tm值与基因序列中的G-C值相关，所以，当扩增产物由于G-C值的不同而出现相对应的不同Tm峰值时，可以通过这个特征峰将特异产物与其他产物区分开，达到鉴别诊断的目的。

伴侣groEL是一种热激蛋白，辅助蛋白质的加工和装配，具有重要的免疫原性，可刺激T细胞和B细胞并直接诱导细胞因子的分泌。胞内寄生菌可将groEL蛋白分泌到宿主细胞质中。埃里希氏体groEL基因在不同种属间具有较大的变异性，常用作分子流行病学调查及菌种鉴定的靶基因[15]。

莱姆疏螺旋体主要的外膜蛋白有6种，其中ospA(the outer surface protein A)存在于90%的伯氏疏螺旋体中，是最主要的外膜蛋白之一。研究表明，ospA对螺旋体在硬蜱中肠定居至关重要[16]，其编码基因是分子生物学诊断的主要检测靶基因，对多位点进行PCR诊断的同时也可对伯氏疏螺旋体进行分型[17]。

本研究成功建立同时诊断埃里希氏体病和莱姆病的双重荧光定量PCR方法，该方法反应条件及程序同时适用于普通PCR扩增反应，为同时对埃里希氏体和伯氏疏螺旋体的分子流行病学调查和埃里希氏体病及莱姆病的防控提供技术支持，由于本研究选择的基因在宿主蜱及患病动物体内均可表达，故本研究同时具有检测患病动物血液是否含有菌株的潜力，有待后续研究的进一步探索。