35味中草药提取物体外抑菌活性的研究

高 语

喀什大学生命与地理科学学院，新疆 喀什 844000

地理区位、生态条件独特的新疆维吾尔自治区，蕴藏着丰富、上好的中药材资源[1]。南疆四地州(阿克苏地区、喀什地区、和田地区与克孜勒苏柯尔克孜自治州)冬季温和、日照充足、外贸潜力深厚[2]。近些年来，中草药种植业逐渐成为当地农户增收致富的新途径，展现出良好的经济、社会效益，前景广阔。其中已经达到了一定的种植规模、具有地理标志性的中药材有：和田玫瑰、岳普湖孜然、阿克苏甘草、乌什沙棘、克州红花与叶城紫草。带动南疆地区中草药种植业的优质、长效发展，需要解决产业链短、附加值低等一系列市场难题。现今，维吾尔民族医药尚缺乏经现代化、规范化研发生产的特色新药品种[3]。新疆深居内陆、气候干燥、人口集中，而抗菌素易积累于稀缺的水资源中[4]，故“减抗”、“替抗”刻不容缓、势在必行。研究中草药材的体外抑菌活性，可以在一定程度上帮助疾病防治、新药开发、环境保护与产业规划。

发达的物流加速了优质药材的流动，为民族药剂创新搭建了崭新的平台。全国各族人民在长期实践中发掘的本草、方药[6]，扩展了维吾尔医药的科研视野。表1中列出的35味载于《中华本草》、《维吾尔药志》的药材[7-8]。它们或清热解毒，或化痰止咳，或消肿排脓，或祛风解表，或理血固涩，常被用于抗炎、杀菌[9]，且疗效确切、基源可靠。

表1 35种供试草药

表2中列出的14种标准指示菌在有氧环境中生长良好。其中的革兰氏阳性(G+)球菌S.a、S.p，革兰氏阴性(G-)肠杆菌K.p、E.c与G-非发酵菌P.a、A.b，是临床感染与传播中最常检出的病原菌[10]。L.m、S.t、S.f常见于食源性人畜共患疾病。P.m、S.m、A.f广泛分布于水与土壤中，是重要的条件致病菌。B.s具有典型的芽孢杆菌特征。C.a是常见于顽固的皮肤黏膜感染的真菌。

表2 14种指示菌株

中草药体外抑菌活性是中医研究的经典课题。早在1947年，徐振氏[11]就进行了400种中草药对4种病原菌的体外抑菌实验。据笔者于2020年10月的查询，中国知网收录的标题中含“中药”与“体外抑菌”的文献已达2651篇。微量增效剂即可大幅提高主方药物的抑菌活性。然而，碍于“试管法”与药敏纸片法程序繁琐，前人的工作大多停留在单方药层次，少见关于药物间增效抑菌的研究。96孔板微量肉汤稀释法操作简便、功能多样、结果可靠。采用此方法，笔者测定35种中草药提取物与10种抗菌素对14种标准指示菌株的MIC90；并在此基础上，进一步测定了10种中草药提取物经超滤离心分离得到的大、小分子的MIC90；筛选出可增效抑菌的药物组合。

1 仪器与材料

1.1 指示菌 K.p、P.a、A.b、S.a、E.c由深圳市呼吸疾病研究所提供，10%甘油冻藏于离心管内。C.a、L.m、B.s、S.p、S.t、P.m、A.f、S.m、S.f购于广东环凯微生物生物技术有限公司，为冻干粉。

1.2 抗菌素 红霉素(ERY)、四环素(TCY)、头孢他啶(CFZ)、卡那霉素(KAN)、万古霉素(VAN)、氯霉素(CHL)、青霉素(PEN)、氧氟沙星(OFX)、多粘菌素B(PB)、美罗培南(MEM)由深圳市呼吸疾病研究所提供。

1.3 中草药 野生人字草、千叶蓍采自喀什市英吾斯坦乡，沙棘、玫瑰、紫草、孜然、甘草、红花为人工栽植品。以上药材经超声清洗后，于干燥箱内烘干。秦艽、伊贝母、洋甘菊、雪莲本草购自新疆伊鼎辉煌生物科技有限公司，为干品。木香、胡黄连30∶1(料液比)提取物购自陕西横岭生物科技有限公司。其余20∶1提取物购自西安金绿生物工程技术有限公司。以上直接购得的提取物均由大宗正品本草经三次75%乙醇提取而成，干粉收率为8%±2%。所有药材标本均保存于喀什大学生命与地理科学学院植物标本室中，经显微形态学鉴定均符合2020年版《中国药典》与以往文献报道中的相关描述。

1.4 试剂 磷酸缓冲盐溶液(PBS)、噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，生工生物工程，批号：F411BA0017)；龙胆苦苷(成都植标化纯生物技术有限公司)；双蒸水(粤戴水处理设备有限公司)；

1.5 培养基 阳离子调节MH肉汤(Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth,CAMHB)，pH 7.2，大连美仑生物，批号:MB2439-Jul-11D)。LB平板(常德比克曼生物科技有限公司)。

1.6 仪器 IX53倒置显微镜(Olympus)；高压蒸汽灭菌器(PHCbi)；KH3200DE型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器)；XA-1型多功能粉碎机(江苏姜堰市分析仪器厂)；ZK-82B真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)；RE100-Pro旋转蒸发仪(Scilogex)；HR40-IIA2型生物安全柜(青岛海尔)；Bluepard THZ-100B恒温培养摇床、Bluepard DHP-9031微生物培养箱(上海一恒)；Centrifuge 5810R大容量离心机、AG22331 Hamburg紫外可见光分光光度计(Eppendorf)；iMark酶标仪(Bio-Rad)；JJ224BC型电子天平(G&G)；PHS-3C酸度计(成都锐新)；075870麦氏比浊管(广东环凯)；5mL截留分子量3kDa超滤离心管(PALL)；各量程单道、八道移液器(RAININ)；

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 提取 将干燥、粉碎、过筛(40目，孔径0.37 mm)的药材粉末称取16 g，置于无纺布袋内，300 mL 60%乙醇70 ℃水浴浸泡2 h。20 kHz超声提取40 min。抽滤除渣。12000 rpm离心3 min。弃沉淀。减压浓缩上清液至稍有固体粉末析出。用双蒸水溶解至10 mL。购得的提取物粉末取1.28 g溶于10 mL双蒸水中。得到生药当量浓度1600 mg/mL的药液。摇匀。加入10 mL 2×CAMHB。得到800 mg/mL药液。测定pH值。配置与35种药液中最低pH值等同的CAMHB培养基(沙棘，pH 3.76)用于阳性对照。800 mg/mL药液用0.22 um微孔滤膜滤过除菌。置于4℃冰箱备用。

2.1.2 菌株 菌株经复苏、复壮后，于CAMHB中37 ℃ 120 r/min振荡培养至对数生长期(OD6000.6～0.8)。菌液调节至0.5麦氏单位浊度(OD6250.08～0.13)后，2∶3稀释，使其中含菌1×108cfu/mL。

2.1.3 微量肉汤稀释法测MIC90遵照ISO 20776-1[12]、CLSI M07-A10[13]与M27-S4[14]中关于肉汤微量稀释法的操作规范，在96孔微量稀释板中，一列一药，A孔加入各800 mg/mL药液200 μL；B-G孔内加入100 μL CAMHB；A孔吸取100 μL，依次倍比稀释至G孔，弃余液100 μL。使A-G生药当量浓度 (Crude drug equivalent concentration)ck(k=1、2…7)分别为800、400、200、100、50、25、12.5 mg/mL。由于高浓度中药液呈深色，需要在H孔内各加入800 mg/mL药液100 μL作阴性“药液对照”。留未接菌板作“初始对照”。抗菌素药敏试验无需阴性对照。A-H孔抗菌素浓度梯度ck(k=1、2…8)为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL。如图1所示。

一板一菌。实验组各孔接1 μL 1×108CFU/mL菌液；使其中最终接菌量为1×106CFU/mL。第12列A-D孔加入100 μL CAMHB作空白“肉汤对照”。E-H加入100 μL酸性对照培养基，并同上接菌1 μL，作阳性“生长对照”。加盖，37 ℃恒温培养18 h。MTT可被活菌线粒体中的琥珀酸脱氢酶氧化为蓝紫色结晶。96孔内均加入20 μL 5 mg/mL的MTT PBS溶液(初始对照同)。37 ℃避光30 min。测定OD600。

2.1.4 超滤分离 取4 mL 800 mg/mL药液于3 kDa超滤管中离心至完全分离，得到含大、小分子成分的两组子药液。高温高压灭菌后，子药液分别重复前述步骤，测定MIC90。

2.1.5 数据处理方法 各行A-G、H格抑菌率Ik(k=1、2…7、8)(%)=1-[Ok-(On/Osn)×Osk]/(Op-Ob)×100%。Ok：第k孔中的OD值；On：阴性对照孔OD值；Osn：初始对照该列阴性对照OD值；Op：阳性对照孔平均OD值；Ob：空白对照孔平均OD值；Osk：该列初始对照第k孔OD值；满足In(n∈k)>90%的最低cn记为MIC90。2.1.3、2.1.4中每列药-菌试验重复7次，得离散MIC90数列mp(p=1、2…7)。取mp中的众数记录。

2.1.6 抗菌增效药物组合的筛选 ①制备“增效剂库”。取一96孔板，1-5、7-11列前35孔依药材编号次序加入200 μL 800mg/mL的中药液，5、11两列后5孔加入10种200 μL 16 μg/mL抗菌素，6、12列加入200 μL CAMHB。 ②制备“实验板”。“增效剂库”各孔取2 μL对应加入空白96孔板后，在第该板1-5、7-11列加入98 μL 1/2 MIC90主方的接菌肉汤(空白对照加入等量无菌无药CAMHB肉汤)，6、12列加入98 μL CAMHB。“实验板”加盖，37 ℃培养18 h后，加入MTT。判定清亮孔中的药物组合增效抑菌作用为显著。

2.1.7 棋盘法药物联用将两种抗菌药物倍比稀释为8个浓度梯度。按A-G、8-1浓度递减顺序，各取50 μL两两组合加入96孔平板中，得到每孔100 μL的8×8棋盘矩阵。遵照2.1.3中的方案，9、10列照作两种药物的MIC实验；剩余孔作阴性、阳性、空白对照。留未接菌板作初始对照。

2.2 结果

2.2.1 中草药提取物对标准指示菌株实验中所有空白、阴性对照孔均清亮，阳性对照孔呈深蓝紫色； CLSI M100[15]中涉及到的标准株均为敏感；实验处于正常状态。由表3、4可知，玫瑰对于除C.a外的13种指示菌，秦艽对B.s、E.c、S.f、K.p、A.b，沙棘对P.a，千叶蓍对S.p、K.p和A.b，胡黄连对S.a和A.b，骆驼篷子与红花对E.c，人字草、岩白菜与甘草对S.a，骆驼蓬子与甘草对S.p，薄荷对S.a、P.a，具有较强的抑菌作用。甘草对G+细菌的抑菌活性高于G-细菌。只有紫草、薄荷可以抑制C.a。

表3 10种抗菌素对14种标准指示菌株的MIC90 (μg/mL)

表4 35种中草药提取物对14种标准指示菌株的的MIC90

2.2.2 10种中草药提取液经筛分后成分的结果 选取云南产胡黄连，西藏产岩白菜，新疆产秦艽、沙棘、千叶蓍、人字草、玫瑰、骆驼蓬子、红花、甘草10种中草药液超滤分离。因各子药液体积均不低于原药液的1/3，其生药当量浓度记为800 mg/mL。由表5可知，千叶蓍抗S.p时的活性的物质为3000 Da以下小分子，抗S.t时大、小分子的MIC90等同于未经超滤离心分离的原药液。沙棘在抗P.a、E.c时，大、小分子的MIC90也与原药液相同。秦艽、胡黄连、人字草在抑制S.a等菌时的活性物质为3000Da以上大分子。以龙胆苦苷为代表的裂环环烯醚萜类常被认为是秦艽的特征成分。本实验证实，4 mg/mL的龙胆苦苷对E.c、A.b无抑菌活性。玫瑰(图2.1)、骆驼蓬子、红花、甘草的大、小分子普遍具有协同抑菌作用。人字草的小分子虽然无法直接抑制S.a，但是可以增强其大分子的抑菌能力(图2.2)。岩白菜提取物中的大、小分子在抑制S.a、P.a、E.c时有协同作用，而在抑制A.b时，则大、小分子拮抗。这表明，中草药抑菌是多靶点的。针对不同的菌株，中草药成分的药效作用机制不同。

表5 10种中草药提取液经3 kDa超滤离心管筛分后成分的MIC90

2.2.3 抗菌增效药物组合 秦艽、柴胡、甘草是常用于治疗发热与上呼吸道感染的复方搭配。秦艽可显著增效头孢他啶对大肠埃希菌的抑菌活性(图2.3)；50%抑菌折点为CFZ 0.125 μg/mL、秦艽12.5 mg/mL。CFZ抑制转肽酶在细菌细胞壁形成过程中的转肽作用。牛俊瑞[30]的研究指出，破坏生物膜可有效抑制E.c，且只有当头孢他啶与黄芩等中药提取物的浓度均达到一定阈值时，联合用药才可有效抑菌。此结果与本实验图2.3中明显的横、纵分界线吻合，提示秦艽增效CFZ的抑菌机制可能与破坏E.c的生物膜相关。黏肽合成酶PBP1b是亚-MIC CFZ抑制E.c生物膜形成的主要靶点[31]。童丽艳[32]使用计算机辅助分子对接技术，从104万个化合物中筛选出的4种作用于PBP1b的先导化合物，均具有苯磺酸基团结构，分子量在275～425 Da之间，对E.c、L.m、B.s、S.a、P.a的MIC为175～225 μg/mL。然而，龙胆科植物化学成分中未见此类化合物的报导。秦艽中增效CFZ的化学成分，有待进一步发掘研究。

沙棘可增效CHL、OFX抑制铜绿假单胞菌；50%抑菌折点分别为CHL 8 μg/mL、沙棘6.25 mg/mL与OFX 1 μg/mL、沙棘25 mg/mL。铜绿假单胞菌在呼吸系统感染中最为常见，是呼吸机相关性肺炎的重要病原菌。在沙棘浓度为25 mg/mL时，CHL对P.a的90%最小抑菌浓度可由单用时的16 μg/mL降低至4 μg/mL。CHL通过干扰tRNA结合在在细菌70S核糖体50S亚基上，抑制蛋白质合成。OFX抑制细菌DNA旋转酶的活性而阻止细菌DNA的合成和复制。戴晓天[33]发现，酸性环境抑制P.a的生长与生物膜的生成，并降低P.a蛋白水解酶的分泌；OFX抑制P.a活性随Ph的增高而降低。于是，笔者将沙棘药液Ph调节至7.2再次测试，发现其对OFX的增效作用略微减弱，而对CHL的增效作用无变化(图2.4)。见表6。

表6 抗菌增效药物组合

千叶蓍耐脊薄、干旱，易于栽培，与薄荷、独活、柴胡等多种药物联用时可以有效抑制P.a与A.b。而现今，千叶蓍在南疆地区仍然鲜有栽植。

3 讨论

抗菌素的广泛使用，在有效地控制细菌感染的同时，造成了不同程的残留和耐药性后果。中药以其毒副作用小、无残留、不易产生抗药性等诸多优势，愈加受到科研工作者的重视。各地中药材的研究，都为民族医药的现代化研发提供了参照。据报导，鞣质为500 Da以上的水溶性酚类化合物，存在于70%以上的植物药中，与许多药物的抑菌活性有关[31]；玫瑰中芳香类与多酚类[23-32]，沙棘果中的黄酮、多糖[33-34]，异甘草素对于G+菌[35]，具有较强的抑菌活性。近20年来，尽管分子水平的中草药化合物研究已全面展开，千叶蓍、骆驼蓬子等新疆常见中药材中的化合物的分子作用机制尚不明确，有待进一步研究。

本实验研究了35种中草药对细菌的体外抑菌活性，得到的各MIC90值与文献中记载的研究成果大致相似。但是，由于药品品种、产地、提取工艺的差异，部分结果稍有不同。分级抑菌浓度结果(图2.3～2.4)证明了中药联用可减少抗菌素的用量。与化学特征显著的现代抗菌素“药物”理念不同的是，民族民间医学主张通过调节人体的“气质”，从整体上提高机体的免疫力，以实现病灶的清除。受制于样本来源单一、“南橘北枳”、未进行动物实验，本实验究仍然具有一定的局限性，有待后续研究予以加强。