预处理方式对米糠酵素品质的影响

董欣睿，赵鑫磊, ，杨嵛茜，江连州，于殿宇，包怡红,3,

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；3.黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）

米糠是稻谷碾磨加工形成精米过程中留下的种皮和胚芽的混合物质，是稻谷加工过程中的主要副产物之一，占稻谷总质量的5%～8%[1]。米糠含有多种营养物质及功能性化合物，其中粗蛋白质含量为11%～13%，纤维含量约为11%，油脂含量约为20%，还含有多种矿物质，如铁、磷、镁等[2-3]。有研究表明米糠油具有降低低密度脂蛋白和总血清胆固醇的功效[4]。米糠多用于化肥、动物饲料生产以及化妆品行业。目前，很多学者将米糠作为发酵底物，通过微生物代谢活动产生更多对人体有益的化合物，例如酶、抗氧化剂、生物表面活性剂、有机酸、多不饱和脂肪酸（PUFA）等，进而提高营养物质总含量[5-6]。

酵素一词起源于日本，本意指酶，随着酵素食品种类的增多，其含义延伸为植物通过接种乳酸菌或酵母菌进行发酵所获得的发酵食品。酵素包涵有机酸、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶等多种活性成分，具有抗氧化、抑菌、净化血液、消炎、促进细胞新生等作用[7]。米糠中含有丰富的多糖及脂肪酸，但其无法直接食用，因此发酵制备米糠酵素成为利用米糠的新途径[2]。

超声、微波、焙烤是常见的食品处理技术，三者分别通过空化作用、微波震荡生热、焙烤热效应对物质结构或组成产生影响。王振斌等[8]利用超声波辅助多菌种发酵技术制备葛根酵素，提高酵素中蛋白酶与脂肪酶活力，而尚未见微波与焙烤对酵素品质影响的文献。目前，关于三种预处理方式对米糠酵素品质的影响鲜有报道。pH可反映发酵液中微生物生长代谢情况，液态酵素的pH一般在3～4之间[9]，因此，pH可作为判断发酵是否正常进行的参考指标。由于米糠酵素中蛋白酶的存在，可以水解米糠蛋白生成一定量的L-谷氨酸，L-谷氨酸再经乳酸菌、酵母代谢产生的L-谷氨酸脱羧酶催化转化为GABA，而GABA因其多种生理功能成为植物酵素质量品质的主要标志物之一，并可作为衡量酵素成熟度的主要指标。因此，本文以米糠为原料，经预实验筛选确定的乳酸菌和酵母菌为发酵菌种，γ-氨基丁酸（GABA）含量和pH作为检测指标，首先通过正交试验获得制备米糠酵素最优条件；然后通过单因素实验分别优化不同预处理方式的工艺条件，最后各自在最优处理参数下，比较不同预处理方式对米糠酵素的影响，以期为米糠酵素的制备工艺及米糠资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米糠、γ-氨基丁酸、蜂蜜、乳酸菌（植物乳杆菌Lactobacillus plantarum） 东北林业大食品微生物实验室保存；酵母菌（酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae）安琪酵母股份有限公司。

H/T20MM型台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；722型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DH6000A型电热恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；pHS-3E型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠酵素制备工艺流程

1.2.2 培养基配制

1.2.2.1 种子培养基 MRS（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉5.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，七水磷酸氢二钾2.0 g，三水醋酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，四水硫酸锰0.05 g，溶于1000 mL蒸馏水中，调pH 6.2±0.2，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。YPD（g/L）: 10 g酵母膏，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，溶于1000 mL蒸馏水中，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2.2.2 发酵培养基 将米糠与蒸馏水按料水比1:15（g/mL）混匀，煮沸90 min，5000 r/min离心10 min后取上清液，每50 mL发酵液中添加2.5 g红糖和1.5 g蜂蜜，调pH至6.0，121 ℃灭菌20 min，得米糠发酵液备用。

1.2.3 米糠发酵工艺单因素实验1.2.3.1 发酵时间对米糠酵素GABA含量及pH的影响 在发酵培养基中接入3%复合发酵菌种（植物乳杆菌与酿酒酵母体积比为1:1；植物乳杆菌约为1.1 ×109CFU/mL，酿酒酵母约为1.5×107CFU/mL），在28 ℃的温度下分别静置培养12、24、36、48、60 h，测定GABA含量及pH的变化。

1.2.3.2 发酵温度对米糠酵素GABA含量及pH的影响 在发酵培养基中接入3%复合发酵菌种（植物乳杆菌与酿酒酵母体积比为1:1；植物乳杆菌约为1.1×109CFU/mL，酿酒酵母约为1.5×107CFU/mL），分别在28、30、32、34、36 ℃条件下静置培养24 h后，测定GABA含量及pH的变化。

1.2.3.3 植物乳杆菌与酿酒酵母接种体积比对米糠酵素GABA含量及pH的影响 配制米糠酵素培养基，接种3%复合发酵菌种（植物乳杆菌约为1.1 × 109CFU/mL，酿酒酵母约为1.5×107CFU/mL），如表1所示，分别向发酵液中接入不同比例的乳杆菌与酵母，在温度为28 ℃的条件下静置培养24 h，测定GABA含量及pH的变化。

表1 植物乳杆菌与酿酒酵母接种体积比Table 1 Inoculation volume ratio of Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae

1.2.4 正交试验 为得到制备米糠酵素的最优发酵工艺，在单因素实验基础上，选择发酵时间（h）、发酵温度（℃）、植物乳杆菌与酿酒酵母接种比例3个因素，以米糠酵素中GABA含量为评价指标，采用L9（34）正交试验确定最佳发酵工艺条件，正交试验因素水平表如表2。

表2 发酵条件优化的正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels table of optimization for fermentation conditions

1.2.5 预处理米糠的方法

1.2.5.1 超声预处理米糠的条件 分别在超声功率为180、210、240、270、300 W条件下（此时超声时间为20 min），超声时间为5、10、15、20、25 min（超声功率为240 W），超声处理后的米糠配制发酵培养基，将乳杆菌与酵母按照1:2比例接入发酵液，在30 ℃下培养24 h，测其GABA含量和pH。

1.2.5.2 微波预处理米糠的条件 对米糠原料进行微波预处理，微波功率设为300、400、500、600、700 W（此时微波时间为60 s），微波时间30、60、90、120、150 s（此时微波功率为600 W），微波处理后的米糠配制发酵培养基，将乳杆菌与酵母按照1:2比例接入发酵液，在30 ℃下培养24 h,测其GABA含量和pH。

1.2.5.3 焙烤预处理米糠的条件 对米糠原料进行焙烤预处理，焙烤温度设为180、190、200、210、220 ℃（此时焙烤时间为15 min），焙烤时间为5、15、25、35、45 min（焙烤温度为210 ℃），焙烤处理后的米糠配制发酵培养基，将乳杆菌与酵母按1:2比例接入发酵液，在30 ℃下培养24 h，测其GABA含量和pH。

1.2.6 γ-氨基丁酸的检测 参考赵宏飞[10]等检测γ-氨基丁酸的方法。

1.2.7 谷胱甘肽检测 参考贾贞[11]检测谷胱甘肽的方法。

1.2.8 pH检测 采用pH计测定发酵液的pH,按照说明书操作。

1.2.9 蛋白酶检测 参考杨旭等[12]等方法测定米糠酵素中蛋白酶活力。

1.2.10 乳酸菌菌落数的测定 参照GB 4789.35-2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[13]方法，用10倍稀释法，将体积分数分别为10-2～10-8稀释菌液涂布于MRS培养基上，37 ℃培养48 h后计数。

1.2.11 酵母菌菌落数的测定 参照GB 4789.15-2016 《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[14]方法，用10倍稀释法，将体积分数分别为10-2～10-7稀释菌液涂布于YPD培养基上，28 ℃培养48 h后计数。

1.3 数据处理

所有试验平行测定3次，运用SPSS18.0与Graphpad Prism 7.0软件进行数据的统计分析以及相关图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 米糠发酵条件单因素实验结果

2.1.1 发酵时间对米糠发酵的影响 图1可知，不同发酵时间对应的发酵液pH均在3.43～3.71范围内，且在发酵时间12～60 h范围内，pH呈现逐渐降低趋势。当发酵时间为12 h时，米糠酵素中GABA含量为0.93 g/L；随着发酵时间延长，酶产物的增加，当发酵时间为24 h时，米糠酵素中GABA含量达到最大0.95 g/L。随着发酵继续进行，相关酶的活性受到体系各因素的影响（如米糠培养基底物消耗）而降低[15]，导致米糠酵素中GABA含量降低。

2.1.2 发酵温度对米糠发酵的影响 从图2可知，实验温度范围内，发酵24 h，发酵液pH在3.41～3.69之间，发酵温度从28 ℃升高到30 ℃时，pH下降较快，超过30 ℃以后pH下降缓慢，当达到34 ℃还略有上升。米糠酵素中GABA含量随温度升高，呈先上升后降低的趋势。当发酵温度升高至30 ℃时，米糠酵素中GABA含量达到最大值为0.88 g/L，随后GABA含量降低。胡超等[16]用高产GABA的酵母发酵生产GABA的最适温度也是30 ℃，温度偏低或者偏高对菌株的生长和代谢会有影响，从而影响GABA的产量及发酵液pH。

图1 发酵时间对米糠酵素产γ-氨基丁酸与pH的影响Fig.1 Effect of fermentation time on GABA and pH of rice bran ferment

图2 发酵温度对米糠酵素产γ-氨基丁酸与pH的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on GABA and pH of rice bran ferment

2.1.3 植物乳杆菌与酿酒酵母接种比例对米糠发酵的影响 如表3所示，当发酵培养基中只接种乳酸菌或者酵母菌时，米糠酵素中GABA含量均不如混菌发酵时产量高，且pH均在3.5左右，因此混菌发酵要好于单菌发酵。当乳酸菌与酵母菌接种比例为1:2时（6号组），米糠酵素中GABA含量最高，为1.17 g/L。张旭普等[17]研究发现，植物乳杆菌与酿酒酵母混合发酵相比于单菌发酵在菌体代谢方面更有潜力，这可能是由于两种菌的代谢产物在一定生长阶段存在某种互生关系，同时也有相关酿酒酵母及乳酸协同发酵研究佐证[18-19]。

表3 不同接种比例米糠酵素中GABA含量及pH检测结果Table 3 Detection results of GABA and pH in rice bran ferment with different inoculation ratios

2.2 米糠酵素发酵条件正交实验优化结果

在单因素实验基础上，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）、乳酸菌与酵母接种体积比（C）三个因素，以发酵液中GABA含量为评价指标，确定制备米糠酵素的最优发酵工艺条件。

米糠酵素发酵工艺的正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。由表5可知，三个因素对GABA产量影响的极差顺序大小为B＞A＞C，方差分析表明，发酵温度对米糠酵素发酵具有显著影响（P＜0.05），发酵时间和乳酸菌与酵母菌接种比对发酵无显著影响（P＞0.05）。直观分析可知，最优发酵工艺条件为A2B2C2，即发酵温度为30 ℃，发酵时间为24 h，乳酸菌与酵母菌接种比为1:2，但此工艺条件不在正交表的9组实验中，需对正交试验优化结果进行验证。

表4 米糠酵素发酵工艺条件优化正交试验结果（n = 3）Table 4 Result of orthogonal test for rice bran ferment fermentation conditions optimization (n = 3)

表5 以米糠酵素中GABA含量为评价指标的方差分析Table 5 Analysis of variance using GABA content in rice bran ferment as an evaluation index

2.3 发酵工艺验证试验

为验证正交试验优化结果的准确性，以发酵温度30 ℃，发酵时间24 h，乳酸菌与酵母菌接种比为1:2时，测得GABA含量为1.41 g/L，此GABA产量高于正交表9组实验中的最优实验组（第5组A2B2C3结果为1.21 g/L）。因此，米糠酵素最优发酵工艺为发酵温度为30 ℃，发酵时间为24 h，乳酸菌与酵母菌接种比为1:2。

2.4 米糠预处理工艺条件对酵素的影响

2.4.1 超声预处理条件对米糠酵素的影响 由图3可知，米糠酵素中GABA产量会随着超声功率的增大呈现先升高后降低的趋势，而pH呈现先降低后升高的趋势。在超声功率为240 W时，GABA产量达到最大值为2.61 g/L，此时pH为最低值3.18（图3a）。米糠酵素中GABA产量与pH随着超声时间延长所呈现趋势与超声功率增大的趋势相同，当超声时间为20 min时，GABA产量达到最大值2.59 g/L，此时发酵液pH为3.14（图3b）。因此，超声米糠的条件为超声功率240 W，超声时间20 min。超声处理后的米糠经发酵制得米糠酵素GABA含量（2.61 g/L）高于未处理的米糠（1.41 g/L），分析其原因可能是由于超声波的空化作用改变了米糠蛋白的四级结构，生成小分子的亚基和肽[20]，当发酵液中有蛋白酶产生时，促进米糠蛋白水解，从而影响米糠酵素中pH及GABA产量。

2.4.2 微波预处理条件对米糠酵素的影响 由图4可知，当微波功率为300 W时，米糠酵素中GABA产量为1.08 g/L，pH为3.56。当微波功率增大至600 W时，GABA产量达到最大值1.47 g/L，pH为3.36。随着微波功率继续增大，GABA产量有降低趋势，pH变化不明显（图4a）。GABA产量随着微波时间延长呈现先升高后降低的趋势，而pH呈现先降低后升高的变化趋势。当微波时间为60 s时，GABA产量达到最大值1.45 g/L，此时发酵液pH为3.32（图4b）。因此，微波处理米糠的条件为微波功率600 W，超声时间60 s。经微波米糠制得的米糠酵素GABA含量（1.47 g/L）大于未经处理的米糠酵素中GABA（1.41 g/L）含量，因为微波使米糠蛋白的空间结构受到破坏，蛋白二级结构螺旋和折叠发生变化，从而增加米糠蛋白溶解性，进而提高发酵液中GABA的产量[21]。然而，微波功率过大及微波时间过长，微波的热作用使蛋白质的球形结构变为棒状结构, 疏水基团暴露, 疏水残基相互作用形成网络, 又会使蛋白的溶解性降低，不利于发酵菌种利用，因此pH会呈现先降低后升高的趋势[22]。

图3 超声预处理米糠对米糠酵素产γ-氨基丁酸产量与pH的影响Fig.3 Effects of ultrasonic treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

图4 微波预处理米糠对米糠酵素产γ-氨基丁酸产量与pH的影响Fig.4 Effect of microwave treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

图5 烘烤预处理米糠对米糠酵素产γ-氨基丁酸产量与pH的影响Fig.5 Effect of baking treatment of rice bran on r-aminobutyric acid production and pH of rice bran ferment

2.4.3 焙烤预处理条件对米糠酵素的影响 由图5可知，随着焙烤温度的升高，GABA产量呈先升高后降低趋势，pH呈先降低后升高的趋势。当焙烤温度达到210 ℃时，GABA产量为最大值0.91 g/L，pH为3.37（图5a）。随着焙烤时间的延长，GABA产量同样呈先升高后降低的趋势，pH呈先降低后升高再略有降低的趋势。当处理米糠的焙烤时间为15 min时，GABA产量达到最大值0.91 g/L，pH为3.32（图5b）。因此，焙烤米糠的温度为210 ℃，焙烤时间为15 min，但经焙烤米糠发酵的米糠酵素GABA含量（0.91 g/L）小于未经处理的米糠制得米糠酵素中GABA含量（1.41 g/L），分析其原因可能为焙烤使米糠中蛋白质在高温加热时，引起蛋白质化学结构发生改变，氨基酸被氧化，氧化后的氨基酸键可以阻止酶的水解反应，从而影响了米糠酵素中pH及GABA产量。

表6 不同条件处理米糠对米糠酵素各指标的影响Table 6 Effects of different conditions on rice bran treatment on various indexes of rice bran ferment

2.5 不同预处理方式对米糠酵素品质的影响

将米糠分别在超声（240 W、20 min）、微波(600 W、60 s)及焙烤（210 ℃、15 min）条件下预处理后，进行发酵制备米糠酵素，米糠酵素中GABA、谷胱甘肽含量、蛋白酶活力、pH、乳酸菌及酵母菌菌落数等各指标检测结果如表6所示。

由表6可知，预处理米糠对米糠酵素各指标的大小有影响。超声处理米糠组的GABA含量及乳酸菌菌落数均为最高，且pH最低，分别为2.61 g/L、3.17 × 108CFU/mL和3.18。未处理米糠组的发酵液中蛋白酶活力高于其他各组，但与超声处理米糠组的差异不显著（P＞0.05）。焙烤处理米糠组的发酵液中谷胱甘肽含量最高为126.28 μmol/L，但其它指标数据显著低于超声处理组（P＜0.05），因此三种预处理方式中，最优处理方式为超声处理。

3 结论

以米糠为原料，以乳酸菌和酵母菌为发酵菌株，通过单因素及正交试验确定制备米糠酵素的最优发酵工艺条件为：发酵温度30 ℃，发酵时间24 h，乳酸菌与酵母菌接种比例为1:2。经超声（240 W、20 min）、微波（600 W、60 s）及焙烤（210 ℃、15 min）预处理米糠制备米糠酵素中GABA、谷胱甘肽含量、蛋白酶活力、pH、乳酸菌及酵母菌菌落数等各指标之间存在差异，其中经超声（240 W、24 h）预处理制备米糠酵素的GABA含量显著高于其他组（P＜0.05）。本文通过三种预处理方式制备米糠酵素，发现制得的米糠酵素各指标之间存在差异，希望为后续米糠酵素的制备提供一种新思路。