外源抑制物对风干肠微生物群落组成变化的影响

陈援援，于德阳，秦建鹏，马俪珍

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384）

风干肠是在适宜的条件下进行风干成熟而制成的一类自然发酵肉制品，因为在风干过程中水分活度和pH逐渐降低，加之优势微生物的竞争作用，所以能抑制产品中有害微生物的生长繁殖，使产品具有营养丰富、色泽美观、风味独特、保质期长等特点，深受北方消费者的青睐[1-3]。

目前，我国风干肠的生产仍然存在一些不容小觑的问题，如传统风干肠的加工是采用自然发酵方式，生产周期长，微生物来源复杂，易受微生物污染而腐败变质，使产品质量不能得到很好的控制，而工业化生产为了提高风干肠的生产效率，使用快速风干成熟法，使风干肠失去了原有的独特发酵风味[4-5]。因此使用天然抑菌剂，研究风干肠在自然发酵过程中微生物数量动态变化及微生物群落结构组成对于实现风干肠发酵过程的人工控制和工业化生产，提高其安全品质具有重要意义[6-8]。风干肠中的主要微生物有细菌、霉菌和酵母[9]。Hu等[10]采用高通量测序技术对东北5个不同地区的风干香肠的细菌群落结构进行了测定，结果表明：硬壁菌和蛋白菌是优势菌门，乳酸杆菌、葡萄球菌、明串珠菌、乳球菌和魏氏菌是优势菌属，木糖葡萄球菌、清酒乳酸杆菌、希腊魏氏菌、柠檬明串珠菌、棉子糖乳球菌和植物乳杆菌为主要优势菌种。Chen等[11]研究表明乳酸杆菌和葡萄球菌是影响哈尔滨干香肠品质的优势菌。本实验室前期将已优选的复合抗氧化剂（Compound antioxidants,CA）、复合香辛料（Compound spice，CS）、发酵牛骨调味基料（Fermented beef flavorings，FBF）及其组合应用到风干肠的加工中，研究了其对产品的风味、生物胺、N-亚硝胺以及脂肪氧化等相关理化指标的影响，发现这些外源抑制物有一定的提高产品风味和安全品质的作用[12-14]。本研究在此基础上，进一步研究这些外源抑制物对风干肠在风干过程中的细菌总数、乳酸菌数、肠杆菌科菌数的变化，并通过16S rDNA高通量测序分析等仪器手段，分析风干终点（12 d）产品的微生物群落组成变化，比较几种外源抑制物对风干肠微生物安全性的影响，以期为风干肠的加工工艺提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猪后腿肉（冷却肉）、猪肥膘 天津市康宁肉制品有限公司；食盐、白沙糖、曲酒、味精、酱油、葡萄糖、木糖 天津市红旗农贸批发市场；冷冻牛骨肉末（骨肉比为3:7） 天津挂月食品有限公司；胡椒精油、姜油、花椒精油、八角精油、丁香精油 顶兴（天津）食品科技发展有限公司；茶多酚、迷迭香 豫中生物科技有限公司；VE、Vc、VB1苏州佰亿鑫生物科技有限公司；VHI-41（木糖葡萄球菌+戊糖片球菌+植物乳杆菌） 意大利萨科公司；风味蛋白酶（酶活力500 LAPU/g）、复合蛋白酶（酶活力1.5 AU/g）丹麦诺维信公司；L-半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸 冀州市华阳化工有限责任公司；人工胶原蛋白肠衣（牛二层皮提取、孔径30 mm） 神冠控股（集团）有限公司（以上材料均为食品级）；MRS培养基、营养琼脂、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂 青岛高科技工业园海博生物科技有限公司。

SX-500高压蒸汽灭菌锅 日本TOMY有限公司；CLIMACELL恒温恒湿箱、Friocell 22恒温恒湿培养箱 艾力特国际贸易有限公司；BVBJ-30F真空搅拌机 浙江嘉兴艾博实业有限公司；XZ-5L灌肠机 广州旭众食品机械有限公司；CLASSⅡ生物安全柜 天美（中国）科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 风干肠的制作 参照李木子等[15]的方法。

1.2.2 几组外源抑制物的配制方法

1.2.2.1 CA的配比 按照熊凤娇等[12]的研究结果，以每组的总肉量计，依次添加茶多酚60.14 mg/kg、迷迭香60.11 mg/kg、VE60.00 mg/kg和抗坏血酸钠60.00 mg/kg。

1.2.2.2 CS的配比 按照陈文静等[16]的研究结果，以每组的总肉量计，依次添加胡椒精油、姜油、花椒精油、八角精油、丁香精油的含量分别为2.08、3.12、3.69、2.83、0.22 mL/kg。

1.2.2.3 FBF的制备 参照樊晓盼等[17]的方法。

1.2.3 试验设计方案 按照1.2.1风干肠的制作方法制作出6组风干肠，CK（Control group，CK）组作为空白对照组，风干肠的原辅料配比同1.2.1，其它5组风干肠均是在CK组的基础上添加不同种类的外源抑制物，其中CA和CS分别按照1.2.2.1和1.2.2.2的比例添加，FBF按照原料肉重的2%比例添加。具体试验设计方案见表1所示。各组分别在风干成熟过程的第1、3、6、9、12 d取样，进行菌落总数、乳酸菌数、肠杆菌科菌数的测定；取6组风干肠成品（风干成熟第12 d）进行微生物多样性分析。

表1 试验设计方案Table 1 Scheme of experiment design

1.3 指标测定方法

1.3.1 乳酸菌总数 按GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[18]6.2.3.4乳杆菌计数方法执行。

1.3.2 菌落总数 按GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[19]方法进行检测。

1.3.3 肠杆菌科总数 按GB 4789.41-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验》[20]执行。

1.3.4 微生物多样性分析 将6组风干肠成品送到北京奥维森基因科技有限公司，采用扩增子测序方法分析样品16S rDNA的V3-4区段、细菌群落结构等，对样品进行细菌多样性分析[21]，扩增区段引物序列为：GTACTCCTACGGGAGGCAGCA，GTGGAC TACHVGGGTWTCTAAT。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件计算平均值和标准差，用SPSS软件进行显著性分析，Origin 10.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 6组风干肠在风干过程中乳酸菌数、菌落总数和肠杆菌科菌数的变化

6组风干肠在风干过程中乳酸菌数、菌落总数和肠杆菌科菌数的变化见图1所示。由图1可以看出，各组样品的乳酸菌数、菌落总数和肠杆菌科菌数变化趋势基本一致，在风干前6 d呈升高趋势随后缓慢下降，此变化与韦友兵[22]研究萨拉米发酵成熟过程中微生物菌群变化趋势基本一致。各组的乳酸菌数由风干第1 d的6.00～6.28 lg CFU/g升高到第6 d的8.64～9.18 lg CFU/g再到第12 d的7.33～8.41 lg CFU/g（见图1A）。菌落总数的变化趋势，风干第1 d为5.70～6.12 lg CFU/g，风干第6 d达到最大值8.09～8.84 lg CFU/g，然后缓慢降低到风干12 d为7.44～8.33 lg CFU/g（见图1B），肠杆菌科菌数在风干第6 d达到最大6.90～8.47 lg CFU/g，风干结束时降低到5.40～6.79 lg CFU/g（见图1C）。各组风干肠之间在风干过程中的菌数未呈现规律性变化，比较6组风干肠之间在风干第12 d的菌数变化，乳酸菌数从高到低依次为：CK＞FBF≈CS≈CA＞CSA＞FBFA，菌落总数从高到低依次为：CK＞FBF＞CS＞CA＞CSA＞FBFA，肠杆菌科菌数从高到低依次为：CK＞CA＞CS＞CSA＞FBFA＞FBF。由此可以看出，添加了外源抑制物的5组试验组的各种菌数均显著低于CK组（P＜0.05），特别是FBF组的肠杆菌科数明显降低，FBFA组的菌落总数为组内最低，说明添加FBF和FBFA对有害微生物有较好的抑制作用。吴晨燕等[23]研究FBF对大肠杆菌的抑菌作用及机理，通过扫描电镜观察菌体形态，测定相对电导率了解胞膜通透性时发现，FBF会破坏细胞的正常形态，使菌体表面出现褶皱、孔洞，影响菌体营养物质的正常传递和运输，从而抑制大肠杆菌生长，这对于控制风干肠的安全性有利，因为肠杆菌科细菌属于条件致病菌[24]。但是，仔细观察FBF组、FBFA组和CSA组的肠杆菌科数仍高达5.40～5.54 lgCFU/g，瑞士对发酵成熟的生香肠中的肠杆菌科限量值为100 CFU/g[25]。虽然目前我国对发酵成熟的生香肠中的肠杆菌科数没有限量标准，但为了提高风干肠的品质和安全性，考虑在后期研究中应采用人工接种乳酸菌和天然抗氧化剂，利用优势菌群等温和的栅栏技术来控制杂菌的繁殖。

图1 不同外源抑制物组风干肠在风干过程中乳酸菌总数、菌落总数和肠杆科菌数的变化Fig.1 Changes of total number of lactic acid bacteria, total number of colonies and the number of Enterobacteriaceae in airdried sausages with different exogenous inhibitors

2.2 6组风干肠成品的微生物多样性指数分析

利用Alpha多样性指数goods_coverage、chao1、observed species及shannon可进行样品微生物物种丰富度和多样性评估[26]。6组风干肠成品的Alpha多样性指数分析结果见表2所示。由表2可知，6组风干肠成品的测序覆盖率goods_coverage在99%以上，说明风干肠中未被测到的序列概率很低。CK组的chao1和observed_species指数高于5个试验组，因为外源抑制物的抑菌成分能够起到一定的抑菌作用，所以添加了外源抑制物的CA、CS、FBF、FBFA、CSA组的菌群丰度均低于CK组。另外，FBFA组的chao1和observed_species指数达到了组内最低，且shannon指数低于FBF组，说明物种多样性最低，且FBF与CA复配的抑菌效果优于FBF单独使用。

表2 6组风干肠成品的Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity index of 6 groups of air-dried sausages products

2.3 基于门水平的微生物群落结构分析

图2为6组风干肠成品在门水平上最大丰度排名前5的物种相对丰度所占比例。由图2可知，6组风干肠成品的微生物群落主要由5个门组成，分别为：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes），各组基于门水平的微生物群落主要是由厚壁菌门和变形菌门组成，占比达到96%以上。进一步分析发现，CSA组、FBF组和FBFA组厚壁菌门所占的比例最大，分别为74.87%、74.51%、68.89%，变形菌门其次，分别为23.82%、22.99%、29.51%；相反，CK组、CA组、CS组变形菌门比例最高分别为60.34%、59.33%、71.64%，其次是厚壁菌门，占比分别为38.14%、39.25%、27.03%。

图2 6组风干肠成品基于门水平的微生物群落结构组成及相对丰度Fig.2 Composition and relative abundance of microbial community structure based on phylum level in 6 groups of air-dried sausages products

2.4 基于属水平的微生物群落结构分析

6组风干肠成品基于属水平的微生物群落结构组成及相对丰度分析结果见图3所示。由图3可以看出，除CSA组含有19个属水平的微生物群落组成，相对丰度为98.91%外，CK组、CA组、CS组、FBF组、FBFA组均包含20个属，相对丰度分别为99.19%、99.54%、99.17%、98.92%和99.21%，6组风干肠样品在属水平的群落结构组成基本一致，均以变形杆菌属、乳球菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属、肠球菌属占主要部分，但相对丰度差异较大，CK、CA、CS组的优势菌属为变形杆菌属，其相对丰度分别为50.89%、55.33%、60.97%，其次为乳球菌属和葡萄球菌属；而CSA、FBF、FBFA组的优势菌属为乳球菌属，其相对丰度分别为49.57%、47.46%、40.09%，其次从高到低依次为变形杆菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属。6组风干肠样品中乳酸杆菌属在FBF组中的相对丰度最大（9.08%），FBFA次之（5.24%），肠球菌属在CK组中的相对丰度最高（5.42%）。由此可以看出，外源抑制物CA、CS、CSA、FBF、FBFA均能影响风干肠中微生物群落结构的相对丰度，值得关注的是，CSA组、FBF组和FBFA组的乳球菌属为优势菌，说明这三组更有益于乳酸菌的生长繁殖。在发酵肉制品加工中，常接种乳酸菌发酵剂来形成产品独特的风味[27]，抑制腐败菌的生长繁殖，延长保质期[28]，在一定程度上提高了产品的安全性[29-30]。研究表明，乳酸菌在发酵过程中能产生多种抗菌物质和抗氧化产物[31-32]，如Nisin细菌素[33]、乳酸乙酸等有机酸、过氧化氢、乙醇、乙醛、丁二酮等[34]。此外，大部分葡萄球菌对发酵肉制品风味的形成具有明显的促进作用，因为它们具有蛋白和脂肪水解酶活性，能对蛋氨酸、苯丙氨酸和一些支链氨基酸进行降解生成醛、醇和酸等前体风味物质[35-36]。本试验的6组样品中葡萄球菌属丰度的大小关系为FBFA＞CA＞CSA＞FBF＞CK＞CS，这说明将FBF与CA复配添加到风干肠中能提高产品中葡萄球菌属的相对丰度。

图3 6组风干肠成品基于属水平的微生物群落结构组成及相对丰度Fig.3 Composition and relative abundance of microbial community structure based on genus level in 6 groups of air-dried sausages products

3 结论

随着风干时间的延长，6组风干肠样品中的微生物数量呈先升高后降低的趋势，FBFA能有效的控制成熟风干肠的乳酸菌和菌落总数，FBF对肠杆菌科的生长有明显抑制作用。微生物多样性分析表明，变形杆菌属、乳球菌属、葡萄球菌属、乳酸杆菌属和肠球菌属是风干肠中的主要微生物菌群，其中添加外源抑制物CSA、FBF、FBFA的风干肠有利于乳球菌属微生物的生长。因此，实验中筛选出的FBF、FBFA适合作为传统风干肠的天然抑菌剂，在一定程度上提高了风干肠的食用安全性，为传统风干肠天然抑菌剂研制提供了一定的实验基础。关于该抑菌剂在其他传发酵肉制品中的应用及与其他菌种结合开发复配抑菌剂还需进一步研究。