miR-26a调控PTEN基因降低小鼠慢性淋巴白血病细胞的耐药性

毛洪宾，何 明

(1.开封市人民医院 临床药学科，河南 开封 475000； 2.河南大学第一附属医院 临床药学科，河南 开封 475001)

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是临床常见的一种白血病，以外周血淋巴细胞增高及骨髓成熟淋巴细胞浸润为主要特征[1]。患者在化疗过程中对药物的敏感性降低，继而产生耐药性，如何避免耐药现象出现是治疗CLL的关键[2]。微小RNA(microRNA)参与多种生理病理过程，与肿瘤细胞的化疗敏感性和耐药性有关，miR-26a能够调节化疗药物的敏感性[3]。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)是一种抑癌基因，其表达降低是肾癌预后不良的有效指标[4]。PTEN参与CLL细胞对氟达拉滨耐药，且miR-26a可通过调节PTEN表达参与肿瘤细胞生理病理过程，但两者在CLL耐药性中报道较少[5]。本研究通过观察miR-26a调控PTEN对小鼠L1210细胞系和小鼠耐顺铂(cisplatin，DDP)L1210/DDP细胞亚系耐药性的影响，探讨其可能作用机制，旨在为临床治疗CLL提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：小鼠淋巴细胞白血病L1210细胞系(中国科学院上海细胞库)。小鼠耐DDP淋巴细胞白血病L1210/DDP细胞亚系(上海奥陆生物科技有限公司)。

1.1.2 药物、主要试剂：注射用DDP(山东齐鲁制药厂)；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；MTT试剂(Sigma Aldrich公司)；pcDNA-miR-26a-inhibitor质粒、pcDNA-miR-26a-inhibitor-NC质粒(广州锐博生物科技有限公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen公司)；野生型和突变型PTEN重组质粒(上海生工生物工程股份有限公司)；兔抗小鼠PTEN、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase，AKT)多抗、p-AKT多抗和山羊抗兔IgG-HRP(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：将L1210细胞接种于质量分数10% FBS及1%青链霉素的DMEM培养基，于体积分数5% CO2培养箱内37 ℃常规培养；L1210/DDP细胞接种于DDP终浓度为0.1 mg/L的DMEM培养基，实验前1周撤药，取对数增殖期细胞用于后续实验。

将细胞分为对照组(L1210细胞)、耐药组(L1210/DDP细胞)、NC组(pcDNA-miR-26a-inhibits-NC质粒+L1210/DDP细胞)和抑制剂组(pcDNA-miR-26a-inhibits质粒+L1210/DDP细胞)。按照LipofectamineTM2000说明书将其进行转染，继续培养24 h。

1.2.2 RT-qPCR检测细胞中miR-26a、PTEN mRNA表达量：取稳定转染的各组细胞，提取总RNA，反转录cDNA，进行PCR扩增。扩增条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，70 ℃延伸30 s，共40个循环。miR-26a上游引物：5′-AATC GAATTCGCTGAGTCAGA-3′；下游引物：5′-CATAAG GCGTCGAGTGCAACC-3′。U6上游引物：5′-ACTG CATGCCATTGCAGTC-3′；下游引物：5′-ACCGTG AACTTGCCTGCAA-3′。PTEN上游引物：5′-AGGT TCAGCTAGCTATGGCA-3′；下游引物：5′-CAGCCTA AACTGCTAGCTAA-3′。β-actin上游引物：5′-AGC AGCAGTTATACTAGCA-3′；下游引物：ACTAGCTAG CATCATGCAA-3′。miR-26a以U6为内参，PTEN以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算miR-26a、PTEN mRNA表达水平。

1.2.3 miR-26a与PTEN靶向性的检测：预测miR-26a 3′UTR与PTEN之间的结合位点，分别构建野生型重组质粒pMir-PTEN-WT和突变型重组质粒pMir-PTEN-MUT，分为野生型NC组、野生型+miR-26a组、突变型NC组、突变型+miR-26a组，利用LipofectamineTM2000将miR-26a-mimics/miR-26a-mimics-NC与pMir-PTEN-MT/pMir-PTEN-MUT质粒共转染L1210细胞，按试剂盒说明书操作，计算相对荧光素酶活性。

1.2.4 耐药性的检测：取稳定转染的各组细胞，接种于96孔板，待细胞汇合至70%左右时，加入含DDP(0.02、0.2、2、20和200 g/mL)的DMEM培养基，48 h后，每孔加入MTT(5 g/L)溶液20 μL，继续培养2 h后弃上清液，加入DMSO 150 μL/孔，充分振荡10 min，用酶标仪测定490 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞抑制率，细胞抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%，绘制细胞抑制率曲线，根据曲线拟合方程求出L1210细胞、L1210/DDP细胞对DDP的半数抑制浓度(half maximal inhi-bitory concentration，IC50)。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率：取稳定转染的各组细胞，PBS洗涤，2 500 r/min离心5 min，结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混匀，4 ℃避光孵育15 min，10 μL PI染色5 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6 Wetern blot检测细胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白相对表达量：取稳定转染的各组细胞，加入RIPA 裂解液裂解细胞，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性，进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST溶液洗膜，分别加入1∶1 000稀释的PTEN、PI3K、AKT、p-AKT和β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗涤后加入HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室温孵育2 h，加入ECL化学发光试剂，显影、定影、拍照，分析各目标蛋白条带吸光度值，以目的蛋白条带吸光度值与内参β-actin条带吸光度值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞耐药对miR-216、PTEN mRNA表达的影响

L1210/DDP细胞中miR-26a mRNA表达明显降低，PTEN mRNA表达明显升高(P<0.05)(表1)。

表1 细胞耐药对miR-26a、PTEN mRNA表达的影响

2.2 转染miR-26a对miR-26a、PTEN mRNA表达的影响

与NC组比较，耐药组、抑制剂组miR-26a mRNA表达降低，PTEN mRNA表达升高，且抑制剂组miR-26a mRNA表达低于耐药组，PTEN mRNA表达高于耐药组(P<0.05)(表2)。

表2 转染miR-26a对miR-26a、PTEN mRNA表达的影响

2.3 miR-26a靶基因验证

生物信息预测显示，miR-26a与PTEN存在连续结合位点(图1)。

野生型NC组、野生型+miR-26a组、突变型NC组、突变型+miR-26a组相对荧光素酶活性分别为：(1.31±0.15)、(0.73±0.08)、(1.29±0.14)和(1.32±0.13)。与野生型+miR-26a组比较，野生型NC组、突变型NC组、突变型+miR-26a组相对荧光素酶活性显著升高(P<0.05)。野生型NC组、突变型NC组、突变型+miR-21组相对荧光素酶活性无差异(图1)。

图1 miR-26a与PTEN的结合位点Fig 1 Binding site of miR-26a and PTEN

2.4 细胞抑制率及对DDP的IC50值比较

不同浓度DDP处理细胞后，耐药组细胞抑制率降低，抑制组细胞抑制率升高(P<0.05)(图2)。

图2 细胞抑制率比较Fig 2 Comparison of cytostatic rate

对照组、NC组、耐药组、抑制组细胞对DDP的IC50值分别为：(1.12±0.13)g/mL、(1.07±0.12)g/mL、(6.35±0.65)g/mL和(0.16±0.02)g/mL。与对照组、NC组比较，耐药组细胞IC50值升高，抑制组细胞IC50值降低(P<0.05)；且抑制组细胞IC50值低于耐药组(P<0.05)。对照组和NC组细胞IC50值无差异。

2.5 细胞凋亡率比较

对照组、NC组、耐药组、抑制组细胞凋亡率分别为：(66.28±6.79)%、(64.68±6.64)%、(8.57±1.13)%和(84.26±8.45)%。与对照组、NC组比较，耐药组细胞凋亡率降低，抑制组细胞凋亡率升高(P<0.05)，耐药组细胞凋亡率低于抑制组(P<0.05)。

对照组、NC组细胞凋亡无差异(图3)。

2.6 细胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白水平比较

与对照组、NC组比较，耐药组、抑制组PTEN蛋白表达升高，PI3K蛋白表达及p-AKT/AKT降低(P<0.05)；抑制组较耐药组PTEN蛋白表达升高，PI3K蛋白表达及p-AKT/AKT降低(P<0.05)(表3，图4)。

表3 蛋白表达水平比较

A.control group; B.NC group; C.resistance group; D.inhibitior group图3 细胞凋亡率比较Fig 3 Comparison of apoptosis rates

A.control group; B.NC group; C.resistancegroup; D.inhibitior group图4 细胞中各蛋白表达Fig 4 Expression of various proteins in cells

3 讨论

miRNA与血液肿瘤耐药性关系密切，其通过调控靶基因表达，抑制或激活下游信号通路，导致肿瘤细胞对药物的敏感度发生改变，引起肿瘤细胞多药耐药，造成化疗效果不佳甚至失败。

miR-26a通过调节靶蛋白表达，导致乳腺癌及非小细胞肺癌细胞对药物的敏感性，影响化疗效果[6-7]。本研究中耐药组细胞miR-26a mRNA表达较高，细胞抑制率和凋亡率较低，对DDP的IC50值维持在较高水平，抑制miR-26a表达后，细胞抑制率和凋亡率明显升高，对DDP的IC50值明显降低，提示过表达miR-26a可增强L1210/DDP细胞对DDP的耐药性。PTEN是体内重要的抑癌因子，具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性，在多种肿瘤中表现缺失或低表达，参与肿瘤发生发展过程[8]。PTEN可以作为miRNA的靶基因，参与人肺腺癌及非小细胞肺癌细胞对化疗药物的耐药性[9-10]。本研究抑制组细胞中PTEN表达较耐药组明显升高，荧光素酶报告结果证实miR-26a与PTEN存在靶向性，提示抑制miR-26a可通过靶向上调PTEN，降低L1210/DDP细胞对DDP的耐药性。

PI3K/Akt信号通路是肿瘤发生发展过程中的重要信号通路，在许多肿瘤组织中过度表达和活化，通过翻译或转录水平引起肿瘤细胞失控性增殖，或下调肿瘤抑制蛋白p53的表达，还可抑制细胞凋亡进程参与肿瘤发生发展过程。PI3K/Akt信号通路与肿瘤耐药关系密切，过度活化的AKT通过抑制凋亡信号激酶活性导致肿瘤细胞产生耐药，与DDP、阿霉素多种化疗药物耐药有关，严重影响化疗效果，抑制PI3K/Akt通路可以逆转肿瘤细胞耐药[11]。PTEN是PI3K/Akt通路的主要抑制分子，通过PI3K抑制下游AKT活化。抑制PTEN表达可以激活PI3K/Akt信号通路，介导乳腺癌细胞的耐药性[12]。过表达PTEN通过抑制PI3K/Akt通路，增强胃肠道间质瘤细胞的化学敏感性[13]。本研究抑制组PTEN蛋白显著升高，PI3K、p-Akt蛋白水平显著降低，提示上调PTEN可以抑制PI3K/Akt通路，miR-26a通过靶向调节PTEN表达，进而影响PI3K/Akt信号通路激活，从而使L1210/DDP细胞耐药性发生改变。

综上所述，L1210/DDP细胞中过表达miR-26a通过靶向抑制PTEN，激活PI3K/Akt信号通路，提高细胞对DDP的耐药性，抑制miR-26a表达可以降低细胞耐药性，体内实验尚需进一步研究探讨，以期为临床治疗CLL提供参考。