STAT3通路参与白细胞介素-22促进人结肠癌细胞系HT29紧密连接蛋白的表达

宋 茜，黄 雪*，覃蒙斌，张君红，井 洁，罗毅华，李雨芯

(1.广西医科大学第一附属医院 老年病学消化科, 广西壮族自治区 南宁 530021；2.广西医科大学第二附属医院 消化内科，广西壮族自治区 南宁 530000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是肠道的慢性非特异性炎性疾病[1]。UC的发病机制与肠屏障损伤密切相关[2-3]。肠上皮屏障是肠屏障最重要的组成成分，而紧密连接在肠上皮屏障中发挥着重大作用。紧密连接蛋白是形成紧密连接的主干[4-5]，由跨膜蛋白occludin、claudins、胞内支架蛋白ZO、连接黏附分子JAM等蛋白组成[6]，细胞因子在紧密连接的调控中起着重要作用，包括IL-10等[7]。而IL-22作为2000年发现的与IL-10相关的一种新型细胞因子[8]，长期以来被认为是UC组织修复的重要介质[9]，IL-22能通过活化STAT3通路在UC中起保护作用，主要表现为修复黏膜创口、阻止肠腔菌群移位和刺激肠上皮细胞、潘氏细胞分泌多种抗菌肽等[10]，但其对肠上皮屏障中紧密连接的影响及机制尚不明确。此研究主要探讨IL-22对HT29细胞的紧密连接蛋白表达的影响及其是否通过STAT3通路参与调控，旨在更全面的了解IL-22在肠上皮屏障功能调节中的作用，为寻找治疗UC的新药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人结肠癌细胞系HT29(中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 试剂与试剂盒：胎牛血清和RPMI-1640培养基(Biological Industries公司)；TBST缓冲液(Solarbio公司)；IL-22(Peprotech公司)；STAT3通路抑制剂FLLL32和STAT3通路激活剂colivelin(APE-BIO公司)；LV-STAT3-RNAi病毒和shNC阴性对照病毒(吉凯基因)；claudin-1和claudin-2抗体(Abcam公司)；ZO-1抗体(Millipor公司)；occludin、STAT3、p-STAT3和GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司)；鼠二抗和兔二抗(Earthox公司)；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒、SYBR Rremix Ex TaqTMⅡ试剂盒和PCR引物序列(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：采用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)培养HT29细胞，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞汇合至80%左右时，更换新鲜培养基，进行传代培养或用于后续实验。将细胞分为1)对照组：未处理；2)IL-22组：给予100 ng/mL的IL-22处理24 h；3)FLLL32组：用10 μmol/L的FLLL32对HT29细胞进行预处理4 h后给予100 ng/mL的IL-22干预24 h；4)colivelin组：用0.5 μmol/L 的colivelin 对HT29细胞进行预处理4 h后给予100 ng/mL的IL-22干预24 h；5)shNC组：转染阴性对照病毒；6)shNC+IL-22组：转染阴性对照病毒后给予100 ng/mL的IL-22干预24 h；7)shSTAT3组：转染LV-STAT3-RNAi；8)shSTAT3+IL-22组：转染LV-STAT3-RNAi后给予100 ng/mL的IL-22干预24 h。细胞转染：待细胞汇合度达70 %左右时，参照吉凯基因慢病毒转染说明书步骤将LV-STAT3-RNAi及其阴性对照根据分组转染至HT29细胞中。

1.2.2 Western blot检测STAT3、p-STAT3、ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2蛋白：提取各组细胞总蛋白，上样至SDS-PAGE凝胶中电泳分离蛋白，然后转至 PVDF 膜上。使用含5%脱脂奶粉封闭1 h，加入配好的一抗在4 ℃下孵育过夜(claudin-1、claudin-2、ZO-1、GAPDH、occludin、STAT3和p-STAT3抗体)，使用TBST缓冲液清洗后放入配置好的二抗中避光孵育1 h。TBST缓冲液清洗后将PVDF膜置于Odyssey双色红外荧光成像系统中进行扫描、显影，保存并使用imageJ软件分析数据。

1.2.3 Real-time PCR 检测STAT3、ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2的mRNA：使用RNAiso Plus提取各组细胞中的RNA，并使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒反转录为cDNA。使用SYBR Rremix Ex TaqTMⅡ试剂盒及ABI 7500 real-time PCR system进行PCR实验。实验结果通过2-△△Ct方法计算。

1.2.4 透射电镜观察细胞间紧密连接：在各组细胞中加入2.5%的常温戊二醇固定液，常温避光固定5 min，使用细胞刮收集细胞，1 500 r/min离心2 min，收集各组细胞后，使用固定液避光固定30 min,4 ℃保存，用于后续透射电镜观察，拍片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 IL-22对HT29细胞中紧密连接的影响

与对照组相比，IL-22组紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2的表达及其mRNA的表达量均被上调(图1A～C，P<0.05)，电镜下可观察到，相比于对照组，IL-22组的紧密连接更致密，细胞间间隙较狭窄(图1D)。

A.immunoblotting map; B.effect of IL-22 on protein expression in HT29 cells; C.effect of IL-22 on mRNA expression in HT29 cells; D.transmission electron microscopy observation of tight junctions between HT29 cells(×12 000), arrows indicate tight junction; *P<0.05 compared with control group

2.2 STAT3和p-STAT3在IL-22干预的HT29细胞中的表达

与对照组相比，IL-22组STAT3和p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05)(图2)。

2.3 抑制STAT3通路对IL-22干预的HT29细胞中紧密连接的影响

与IL-22组相比，FLLL32组STAT3和p-STAT3表达量减少(图3，P<0.05)，紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2及其mRNA表达量明显下调(图4，P<0.05)，电镜下观测到FLLL32组细胞间间隙较宽(图5)。

2.4 激活STAT3通路对IL-22干预的HT29细胞中紧密连接的影响

与IL-22组相比，colivelin组STAT3和p-STAT3表达量增加(图3，P<0.05)，紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2及其mRNA表达水平上调(图4，P<0.05)，电镜下观测colivelin组紧密连接更致密，细胞间间隙较狭窄(图5)。

2.5 沉默STAT3基因后IL-22不能对HT29细胞中的紧密连接起保护作用

相比于shNC组，shSTAT3组STAT3的mRNA及蛋白表达量明显下调(图6，P<0.05)；相比于shNC+ IL-22组，shSTAT3+ IL-22组p-STAT3的蛋白表达量明显下调(图6，P<0.05)。与shNC组相比，shNC+ IL-22组的紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和claudin-2及其mRNA表达量明显增加(图7A～C，P<0.05)，电镜下观测到紧密连接更致密(图8)。而相比于shSTAT3组，shSTAT3+IL-22组的所有紧密连接的蛋白及mRNA表达量均无明显差异，细胞间间隙也无明显差异(图7，8)。

A.immunoblotting map; B.effect of IL-22 on protein expression in HT29 cells; *P<0.05 compared with control group图2 STAT3和p-STAT3在IL-22干预的HT29细胞中的表达Fig 2 Expression of STAT3 and p-STAT3 in IL-22-interfered HT29 n=9)

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups; *P<0.05 compared with IL-22 group

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups; *P<0.05 compared with IL-22 group

arrows indicate tight junction图5 透射电镜观察抑制STAT3通路及激活STAT3通路对IL-22干预的HT29细胞中紧密连接的影响

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups;*P<0.05 compared with shNC group; #P<0.05 compared with shNC+ IL-22 group

A.immunoblotting map; B.changes of protein expression in all groups; C.changes of mRNA expression in all groups; *P<0.05 compared with shNC group; #P<0.05 compared with shNC+ IL-22 group

arrows indicate tight junction图8 透射电镜观察沉默STAT3基因对IL-22干预的HT29细胞中紧密连接的影响

3 讨论

紧密连接与UC的发生、发展密切相关，UC大鼠模型组与正常对照组比较,紧密连接蛋白 occludin的表达水平显著降低,且与UC炎性反应程度呈负相关[11]。促炎性细胞因子 TNF-α和 IFN-γ 可通过下调紧密连接从而破坏UC的肠黏膜屏障功能[12]，说明紧密连接蛋白表达异常是UC的重要表现。而保护肠上皮屏障紧密连接是一种能够改善UC临床症状的潜在治疗方法。

用IL-22处理HT29细胞后紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1、 claudin-2表达水平升高，细胞间紧密连接更致密，提示IL-22对紧密连接起保护作用。此结果与报道[13]的IL-22可通过增强肠道屏障完整性在UC中发挥有益作用相似。STAT3通路被认为是IL-22最主要的传导通路，其中STAT3的磷酸化是STAT3活化的标志，且是UC发病机制中的重要炎性反应事件[14]。研究中成功抑制STAT3通路后，IL-22处理的HT29细胞紧密连接蛋白及其mRNA表达降低，紧密连接疏松，而成功激活STAT3通路后，IL-22处理的HT29细胞紧密连接蛋白及其mRNA表达升高，紧密连接致密，提示STAT3通路参与IL-22上调紧密连接蛋白表达及保护其紧密连接的过程。且在成功沉默HT29细胞中STAT3基因后发现，IL-22不能上调紧密连接蛋白及其mRNA，这进一步证明了STAT3通路参与这一过程。此结果与报道[10]的IL-22可通过STAT3通路在UC中起保护作用的观点相似。

总之，IL-22可以增强HT29细胞中紧密连接蛋白的表达，促进肠上皮屏障的完整性，STAT3信号通路参与这一过程。