锦鲤昏睡病(KSD)的实验室诊断分析(上)

2021-06-17刘桐山韩进刚冯守明

科学养鱼 2021年5期

刘群，王菁，刘桐山，王钢，韩进刚，冯守明

(1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市水产研究所，天津 300221)

锦鲤昏睡病(KSD)具有发病率高、死亡率高的特点，且呈现逐年上升态势。本研究应用流行病学调查、病理学观察、分子生物学检测等多种方法对天津地区一养殖场不明原因锦鲤死亡病例进行诊断及分析，确诊为由鲤浮肿病毒(Car p edema vir us，CEV)感染引起的锦鲤昏睡病(KSD)。现将其实验室诊断与分析结果报道如下。

一、材料与方法

1.样品取样

疾病暴发时，深入现场调查养殖水温、养殖密度、鱼龄、发病率、死亡率等情况，观察病鱼活动状态。取症状典型的发病鱼活体置于解剖盘中，检查其体表症状，解剖并剪取鳃、肝胰脏、脾、肾、脑组织，用于组织病理观察的组织块(不超过0.5厘米3)置于Davidson's AFA固定液固定；用于超微病理观察的组织块(厚度小于2毫米)置于TEM电镜固定液中固定，并做好记录。

2.寄生虫检查

观察病鱼活动情况，用显微镜检查病鱼有无寄生虫。鳃丝、体表黏液采取水浸片法，脑、肝胰脏、脾、肾组织采用压片法，血液用涂片法。制片后置于显微镜下观察发病鱼体表、鳃和其他内脏组织病变情况。

3.石蜡切片制备与观察

用于组织病理观察的组织块固定24小时后置于70%(体积分数)乙醇，浸泡36小时后即可制备病理切片。经脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、染色、封片等步骤后，使用ZEISS光学显微镜对制备好的病理切片进行显微观察，并用Axio Cam数字摄像头结合Axio Vision图像分析软件进行拍照和测量。

4.透射电镜切片制备与观察

用于超微病理观察的组织块于4℃固定24小时后，0.1摩/升磷酸缓冲液冲洗，再经1%锇酸固定1.5小时，置于梯度乙醇脱水，经包埋剂包埋后制作超薄切片，透射电子显微镜下观察并拍照有无疑似病毒颗粒、形态特征等超微病理变化。

5.细菌分离培养

使用75%(体积分数)乙醇对病鱼体表消毒，无菌环境下采集病鱼脑、肝胰脏、脾、肾组织，于LB琼脂平板划线接种，28℃培养24小时，观察细菌生长情况。

6.分子生物学鉴定

(1)核酸提取。切取濒死病鱼鳃组织并研磨，于1.5毫升RNase-f r ee离心管中挑取少量研磨液，用全自动核酸提取纯化移液工作站(M5073，Eppendor f)提取样品核酸，并使用超微量核酸测定仪(IMPLEN，Ger man)测定其纯度及浓度。

(2)病毒PCR检测。参考鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒II型(CyHV-II)、鲤浮肿病毒(CEV)相关检测方法进行相对应病毒分子生物学检测，同时以健康锦鲤基因组DNA作为阴性对照，相关检测所用引物序列及检测方法信息见表1。

表1 PCR检测所用引物序列

7.人工感染试验

取患病锦鲤鳃组织，按1∶10(质量体积比)加入无菌生理盐水，研磨匀浆并反复冻融，经差速离心收集上清液，以0.22微米滤膜过滤，采用注射终浓度2×10-2克/升组织液方式进行人工感染试验。随机取2组健康锦鲤进行腹腔注射，每组10尾；实验组与对照组分别注射0.2毫升/尾组织悬液与等剂量无菌生理盐水；(25±2)℃下水箱连续饲养31天，观察发病情况，做好记录，并及时剖检实验鱼和检测病原体。

二、结果

1.现场调查及临床症状检查

锦鲤病例样品取自于2018年7月末，养殖池塘水温为26～29℃，起初锦鲤个别死亡，但病情进展迅速。第1天仅死鱼100余尾，第2天死鱼便达500余尾，日死亡率为5%～8%。调查发现，发病锦鲤为9月龄，全长为(14±5)厘米，体质量为(48±10)克，养殖密度约400尾/米3水体。发病鱼普遍表现为横卧漂浮于养殖池浅水区水面，聚集于池角、岸边及进水口等处，体表无明显损伤；活力明显下降，初看似已死亡，一旦有声音刺激便游动，刺激结束后再次横卧，发病死亡率介于50%～80%。体表临床症状为头部上方颅骨软组织皱缩，眼球凹陷(图1)。观察病鱼体表、体内器官，其临床症状表现为鳃黏脏，黏液分泌增多，有的鳃丝不完整，肝胰脏呈现白色，大部分发病鱼脾肿大，其他组织器官无明显异常。

图1 发病锦鲤体表临床症状

2.病理切片观察结果

通过显微病理观察，患病锦鲤各组织器官出现不同程度病理变化，表现为多器官病变病理特征。其中，鳃丝末端细胞增生，呈肿大状并黏附，有融合；鳃小片上皮细胞增生且其之间隙缝被上皮细胞填满，可观察到疑似包涵体存在(图2A)。肾组织可见肾小管上皮细胞脱落水肿，部分水肿至空泡化，肾小球结构清晰可见，组织可见少量炎症细胞浸润和疑似包涵体存在(图2B)。肝细胞胞浆疏松，可见广泛水肿，部分水肿至空泡化，并可见疑似包涵体(图2C)。脾组织整体结构正常，红髓与白髓界限不清，无明显坏死，组织可见疑似包涵体、多核巨细胞和大量黑色素巨噬细胞，未见明显粒细胞浸润(图2D)。脑组织整体结构正常，细胞排列紧密整齐，分界明显，未见血管充血及炎症细胞浸润。