离子液体乳相液液微萃取结合高效液相色谱法测定豆奶中的磺酰脲类除草剂

马铭扬,徐尉力,常珊珊,王 林,梁正基,李吉龙,王志兵

(长春工业大学化学与生命科学学院,吉林长春 130012)

磺酰脲类除草剂(Sulfonylurea herbicides,SUHS)是目前世界上广泛使用的一类除草剂,具有高效性、广谱性和高选择性等优点,常作为植物细胞分裂抑制剂,用于一年生或多年生杂草尤其是阔叶杂草的防治,其作用机理为抑制乙酰乳酸合成酶的合成,阻碍细胞分裂,从而达到灭草的作用[1-2]。由于其具有较高的水溶性,使磺酰脲类化合物易于侵入土壤[3-5]和地表水中[6-8],通过生物富集作用残留于水稻[9]、大豆[10-11]和小麦[12-13]等各种农作物中,继而对各种深加工产品产生影响[14]。市售包装豆奶作为一种新兴的大豆深加工食品,其安全性受到消费者广泛关注。目前,国内外针对大豆豆奶中的多种除草剂残留检测都有了相关报道[15-16],我国国标GB/T 23817-2009中规定原料大豆中磺酰脲类除草剂的限量标准为0.02 mg/kg。因而,建立一种简单、高效的方法用于检测豆奶中磺酰脲类除草剂残留是尤为重要的。

目前,常见的食品中磺酰脲类农残的检测方法[17]有高效液相色谱法[18]、毛细管电泳法[19]和高效液相色谱-串联质谱法[20-21]等,其中高效液相色谱法具有选择性强、灵敏度高、分析时间短等优点,常被用于农残检测。磺酰脲类的样品前处理方法主要有液液萃取、超声提取和固相萃取等[22],这些方法不仅耗时、费力,而且均使用大量传统有机溶剂作萃取剂。离子液体(Ionic liquids,ILs)是由有机阳离子和有机或无机阴离子组成的离子液体,作为一种“绿色溶剂”,具有不挥发、环境友好、热稳定性高和阴阳离子可设计性强等优点[23],常被应用于萃取和分离领域,但由于部分离子液体具有较高的粘度,使其在应用时受到了很大限制。为了提高萃取效率,常常可通过涡旋、超声、微波和加压等辅助手段将离子液体破碎成小液滴[24],从而降低离子液体的表面张力[25-26],加速其在样液中的分散和乳化,增大离子液体与目标物的接触面积,并通过π-π堆积、静电、氢键、疏水作用力等与目标分析物产生相互作用[25]。液液微萃取(Liquid-liquid microextraction,LLME)是在液液萃取的基础上发展而来,因其具有试剂用量少、萃取过程简单的优点而被广泛使用。分散于样液中离子液体与水相之间分离成为了液液微萃取技术的关键步骤。分散固相萃取(Dispersive solid phase extraction,DSPE)是通过向溶液中加入吸附剂而使目标物与样品溶液发生相分离的一种常用于液体样品的前处理方法。萃取时,吸附剂被直接加入到样品溶液中,并经涡流、振荡等方式吸附目标物或其载体,然后通过离心、过滤或磁性等方式与本体溶液分离,具有操作简单、萃取时间短、萃取效率高、试剂用量少等优点[26]。

因此,本研究首次将涡旋-超声协同乳化离子液体液液微萃取与分散固相萃取相结合,对市售豆奶中的6种磺酰脲类除草剂进行萃取分析,以离子液体为萃取剂,经超声-涡旋协助作用促进离子液体与目标分析物的结合,以蒙脱土为吸附剂,通过固相分散吸附离子液体,达到富集目标分析物的目的。最后,通过乙腈解析富集有目标分析物的离子液体,过滤后进入高效液相色谱分析、测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

不同品牌的市售包装豆奶(样品1～8) 均购买于当地超市;磺酰脲类标准品:噻吩磺隆、甲磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、苄嘧磺隆和吡嘧磺隆(纯度均>99.5%,结构如图1所示)、K-10蒙脱土 均购买于阿拉丁试剂公司;中性氧化铝(200～300目)、酸性氧化铝(100～200目)、碱性氧化铝(200～300目)、PSA(200～300目)、硅胶(200～300目)、弗罗里硅土(60～100目) 均购买于中国药品生物制品检定所;三丁基十二烷基膦四氟硼酸盐([P4 4 4 12][BF4])、三丁基十六烷基膦四氟硼酸盐([P4 4 4 16][BF4])、三丁基辛基膦四氟硼酸盐([P4 4 4 8][BF4]) 上海成捷化学有限公司;甲醇、乙腈 色谱级,科隆化学品有限公司;其他试剂 均为分析纯,北京化工厂。

Agilent LC-1100高效液相色谱仪(配有四元泵、真空脱气机以及二极管阵列检测器) 美国Agilent公司;AcclaimTM120-C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm) 美国Thermo公司;Allegra 5430R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;XW-80A漩涡混合器 上海米青科实业有限公司;KQ-100DE超声波清洗器 江苏昆山市超声仪器有限公司。

图1 目标分析物的化学结构Fig.1 Chemical structures of sulfonylurea pesticides注:a:噻吩磺隆;b:甲磺隆;c:醚苯磺隆;d:氯磺隆;e:苄嘧磺隆;f:吡嘧磺隆。

图2 涡旋/超声协同乳化离子液体液液微萃取流程图Fig.2 Schematic procedure of vortex-ultrasonic co-emulsification combine with ionic liquid liquid-liquid microextraction注：A为加标样品，B为混合标准品；1～6分别为：噻吩磺隆、甲磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取噻吩磺隆、甲磺隆、醚苯磺隆、氯磺隆、苄嘧磺隆和吡嘧磺隆标准品各5.0 mg,用乙腈分别定容于10 mL容量瓶中,配制成浓度为500.00 μg/mL的标准储备液,置于4 ℃的冰箱中避光保存。实验所需其它工作溶液均通过乙腈稀释各个标准储备液制得。

1.2.2 蒙脱土改性 取20.0 g的K-10蒙脱土置于玛瑙研钵中,研磨10 min后装于50 mL离心管中,以10.00 mL/g的比例加入乙腈,涡旋5 min,以5000 r/min离心5 min,弃去上清液,烘干后研磨均匀,得到改性蒙脱土。

1.2.3 样品预处理 取40 mL加标豆奶(100.00 μg/L)于50 mL离心管中,加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10%,w/V),震摇混合后超声5 min,然后以5000 r/min离心5 min,取10 mL上清液转移至上下各垫有一层脱脂棉的净化柱中,净化柱中填充有2.0 g的中性氧化铝。最后,定量收集8 mL样液。除实际样品分析外,其余实验结果均由样品1获得。

1.2.4 涡旋/超声协同乳化离子液体液液微萃取 萃取流程如图2所示,将上述8 mL样液置于10 mL离心管中,加入5.0 mg三丁基十二烷基膦四氟硼酸盐([P4 4 4 12][BF4]),涡旋3 min后,按照超声1 min、涡旋30 s的规律交替进行(重复3次),待样液乳化分散后,加入0.15 g改性蒙脱土,涡旋2 min,然后以2000 r/min离心7 min,弃去上清液后,得到吸附有目标物和离子液体的改性蒙脱土,向离心管中加入200 μL乙腈,用封口膜密封后将离心管涡旋1 min,解吸目标物,并以7000 r/min离心2 min,用注射器吸取解吸液,过0.22 μm有机滤膜,进行色谱分析。

1.2.5 色谱条件 流动相由pH=2.5的磷酸水溶液(A)和乙腈(B)组成,梯度洗脱条件为:0 min,40%(B);0～15 min,40%～50%(B);15～20 min,50%～80%(B);20～25 min,80%～70%(B);25～33 min,70%～40%(B);33～40 min,40%(B)。流动相流速:0.5 mL/min;进样体积:20 μL;柱温:35 ℃;检测波长:230 nm。

1.2.6 加标回收率计算公式

加标回收率(%)=(检出量(μg/g)-原始量(μg/g))/加入量(μg/g)×100

1.3 数据处理

本研究以6种磺酰脲类化合物回收率为指标对影响回收率的各个因素进行了优化,并参照实验结果推测各个结果产生的原因。采用Origin 8.0.6软件进行统计分析,对影响目标物萃取效率的离子液体种类、离子液体用量、改性蒙脱土用量、氯化钠用量、离心转速以及pH进行拟合优化,得到最佳萃取条件。通过对工作曲线进行拟合,得到加标浓度与回收率的线性关系。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

通过预实验确定萃取条件的取值范围和最佳值,并在“1.2.3”和“1.2.4”小节所述最优实验条件下,通过改变单一萃取条件进行了正式实验。进一步考察了离子液体种类、离子液体用量、改性蒙脱土用量、氯化钠用量、离心转速以及pH对目标物回收率的影响。

2.1.1 离子液体种类的影响 在本研究中,离子液体作为一种绿色萃取剂,起到结合目标物的作用,由于离子液体的种类很多,为了获得最佳的萃取效果,本研究考察了[P4 4 4 8][BF4]、[P4 4 4 12][BF4]和[P4 4 4 16][BF4]3种不同离子液体对目标分析物回收率的影响。结果如图3所示,[P4 4 4 12][BF4]的萃取效果优于[P4 4 4 8][BF4]和[P4 4 4 16][BF4],这可能是由于[P4 4 4 16][BF4]在室温下难以完全融化,在涡旋-超声协同作用后以大颗粒形态分散在样液中,乳化效果较差,与目标物的接触面积相对较小,同时由于密度最低,使得[P4 4 4 16][BF4]分散时多聚集在上层样液中,无法与目标物充分接触。此外,由于[P4 4 4 8][BF4]的烷基链较短,导致其与目标分析物之间的疏水相互作用较弱,固提取率略低于[P4 4 4 12][BF4]。因此,本研究选择[P4 4 4 12][BF4]作为萃取剂。

图3 离子液体种类对回收率的影响Fig.3 Effect of ionic liquid type on recovery

2.1.2 离子液体用量的影响 离子液体作为吸附与富集目标物的重要载体,其用量的多少决定了对目标物的吸附量以及在蒙脱土上的富集量,所以本研究考察了0.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0 mg[P4 4 4 12][BF4]对目标物回收率的影响。研究发现,随离子液体用量的增加,乳化时间不断延长,蒙脱土吸附后样液浑浊度上升。从图4可以看出,当不使用[P4 4 4 12][BF4]时,蒙脱土仍对目标物具有一定的萃取吸附能力,目标物回收率接近80%～90%,这说明蒙脱土不仅能吸附样液中的某些大电荷阳离子杂质,也能吸附目标物。当离子液体用量逐渐增加时,目标物回收率也随之增加,当[P4 4 4 12][BF4]用量为5.0 mg时,回收率达到最大值。这可能是因为[P4 4 4 12][BF4]通过π-π堆积、疏水作用力等对目标物产生一定的吸附作用,而[P4 4 4 12][BF4]在结构组成上属于阳离子表面活性剂,又能同时与蒙脱土产生较强的静电引力,从而能有效富集目标物于改性蒙脱土上,在一定程度上实现特异性吸附。但当离子液体用量过高时,目标物回收率显著下降,这可能是因为蒙脱土的阳离子交换能力随着离子液体用量的不断增加而减弱,从而造成部分带有目标分析物的离子液体未能被有效吸附。因此,本研究选用[P4 4 4 12][BF4]的用量为5.0 mg。

图4 离子液体用量对回收率的影响Fig.4 Effect of amount of ionic liquid on recovery

2.1.3 改性蒙脱土用量的影响 蒙脱土作为一种天然膨润土,具有较强的阳离子交换功能和吸附能力,本试验以乙腈改性蒙脱土作为固相分散吸附剂,对样液中结合了目标物的离子液体产生吸附作用,其用量的多少对目标物回收率有较大影响。研究发现,相同条件下,乙腈改性蒙脱土比未改性蒙脱土具有更好的吸附效果,目标物回收率更高。这可能是由于乙腈增大了蒙脱土的土层间距,同时交换出一部分阳离子,减少了杂质对萃取效率的影响,并适当的增加了蒙脱土的表面吸附能。实验结果如图5所示,改性蒙脱土用量分别为0.010、0.025、0.050、0.100、0.150、0.200和0.500 g,随着改性蒙脱土用量的增加,目标物回收率先增加后减少,当改性蒙脱土用量为0.15～0.20 g时,目标物回收率达到最大值,但当蒙脱土用量过高时,会导致后续过滤困难。综合考虑,本研究选用0.15 g的改性蒙脱土作为固相分散吸附剂。

图5 蒙脱土用量对回收率的影响Fig.5 Effect of amount of montmorillonite on recovery

同时,为了考察改性蒙脱土对目标分析物的萃取吸附作用,本研究在不使用离子液体萃取剂的条件下,以改性蒙脱土为吸附剂,采用分散固相萃取法分离富集样液中的目标分析物。实验结果表明,改性蒙脱土对噻吩磺隆、甲磺隆和醚苯磺隆具有一定的萃取作用,但同时对一部分大豆异黄酮、蛋白质和钙离子等也有吸附作用,通过对其萃取溶液的色谱峰分析,发现目标物苄嘧磺隆和吡嘧磺隆的色谱峰被严重干扰,无法进行定性定量分析。因此,在本研究中,采用了以离子液体为萃取溶剂和以改性蒙脱土为吸附剂的涡旋/超声协同乳化结合固相分散吸附离子液体液液微萃取法,测定豆奶中残留的磺酰脲类除草剂。

2.1.4 氯化钠用量的影响 氯化钠不仅能增加溶液离子强度,同时作为一种破乳剂,也会对离子液体的乳化效果产生重要影响。所以,本研究考察了不同氯化钠用量(0.01、0.02、0.03、0.05、0.10、0.50 g)对目标物回收率的影响。实验结果如图6所示,随着氯化钠用量的增加,目标物回收率无明显变化。因此,为了简化实验操作,本研究选择不加入氯化钠。

图6 氯化钠用量对回收率的影响Fig.6 Effect of amount of NaCl on recovery

2.1.5 离心转速 为了使改性蒙脱土(结合有目标物与离子液体)与样液分离,本研究考察了不同离心转速(2000、3000、4000、5000、6000、7000 r/min)对固液分离效果和目标物回收率的影响。通过观察分离效果发现,当离心转速低于2000 r/min时,离心管底部的蒙脱土较为松散,易随样液排出,当离心转速大于3000 r/min,改性蒙脱土的致密性逐渐增加,易于实现固液分离。从图7可以看出,随着离心转速的增加,目标物回收率先略微上升后持续下降,当转速达到3000 r/min时,回收率达到最大值。这可能是当离心转速过低时,蒙脱土受到离心力过小,蒙脱土颗粒和层隙存在一部分水,造成蒙脱土颗粒间结合不紧密,易发生断裂和溶胀,当转速过高时则会导致蒙脱土间的水分减少,致密性增加,同时离子液体具有一定的粘性,使得蒙脱土内部的离子液体不易被乙腈解吸,从而使回收率下降。因此,离心转速被选择为3000 r/min。

图7 离心转速对回收率的影响Fig.7 Effect of the centrifugal rotational speed on recovery

2.1.6 pH pH不仅影响样液中目标物和杂质的解离状态,又会引起蛋白质解离平衡的变化。所以,本研究通过HCl溶液(1 mol/L)和NaOH溶液(1 mol/L)调节除去蛋白质后的样液的pH,考察了不同pH(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14)对目标物回收率的影响。结果如图8所示,当样液的pH为6～7时,目标物的回收率达到最大,当样液的pH高于8时,目标物回收率逐渐降低,且样液由无色变为浅绿色,并随pH增加而加深,在后期乙腈解吸时,会发现有少量白色杂质析出。在本研究中,除蛋白后的样品溶液pH为6.16左右,与最适pH接近。因此,本研究选择不调节样液的pH。

图8 pH对回收率的影响Fig.8 Effect of pH on recovery

2.2 方法评价

2.2.1 线性关系、检出限和定量限 精确配制含有6种目标物的一定浓度的混合标准溶液,用乙腈进行梯度稀释,分别加入到空白样品中,形成系列浓度(7.80、15.60、31.25、62.50、125.00、250.00以及500.00 μg/L)的加标样品,在最优实验条件下,采用涡旋/超声协同乳化离子液体液液微萃取结合高效液相色谱法,分析测定各目标物的色谱峰面积,并通过分析11组低浓度(10 μg/L)空白加标样品,计算方法检出限(LODs)和定量限(LOQs)。以加标浓度(c)为横坐标,色谱峰面积(A)为纵坐标,绘制工作曲线。实验结果如表1所示,各目标物线性关系良好(r>0.9990),检出限(LODs)为1.60～3.15 μg/L,定量限(LOQs)为5.34～10.15 μg/L。

2.2.2 精密度 本研究对加标浓度为25.00、100.00和250.00 μg/L的3组加标样品进行测定,以重复测定目标物回收率的相对标准偏差(RSD)表示其精密度。其中,日内精密度是一天内连续分析加标样品6次所得测定结果的相对标准偏差,而日间精密度是每天分析加标样品2次、连续分析3 d所得测定结果的相对标准偏差。实验结果如表2所示,本方法的日内精密度(RSD)为1.31%～5.07%,日间精密度(RSD)为1.12%～6.63%。

表1 线性关系、检出限和定量限Table 1 Linear regression equation,LODs and LOQs for the analytes

表2 日内和日间精密度(n=6)Table 2 Intra-day and inter-day precision for the analytes(n=6)

表3 实际样品分析(n=3)Table 3 Analysis of real samples(n=3)

续表

表4 方法比较Table 4 Comparison of the present method with others

图9 加标样品(A)和混合标准品(B)色谱图Fig.9 Chromatograms of spiked sample(A)and mixed standards(B)注:1:噻吩磺隆;2:甲磺隆,3:醚苯磺隆; 4:氯磺隆;5:苄嘧磺隆;6:吡嘧磺隆。

2.2.3 实际样品分析 为考察本方法的适用性,本研究对7种不同品牌的市售包装豆奶产品进行分析检测,实验结果如表3所示。结果表明,不同品牌豆奶样品的加标回收率在81.55%～116.44%之间,相对标准偏差在0.05%～8.91%之间,分析性能稳定,结果令人满意。从实验结果可以看出,市售包装豆奶样品中并未检出6种磺酰脲类除草剂。图9所示为加标样品提取液色谱图,可以看出各目标物保留时间内无明显干扰峰。

2.2.4 方法比较 为了考察本法的分析性能,将本法与参考文献报道的液液萃取-固相净化法、QuECHERS法、离子液体-液液萃取等方法进行了比较,结果如表4所示。本法以离子液体代替传统有机溶剂作为萃取剂,避免了有机溶剂的大量使用,与传统液液萃取法和QuECHERS法相比,本法萃取过程更环保,实验操作更简单,萃取效率更高。与基于离子液体的分散液液微萃取法相比,本法仅使用5 mg[P4 4 4 12][BF4]作为溶剂,各目标分析物检出限均低于3.15 μg/L,在离子液体用量和检出限方面具有明显优势。

3 结论

本研究采用离子液体作为萃取溶剂,以改性蒙脱土作固相分散吸附材料,将涡旋-超声辅助离子液体乳相液液微萃取和分散固相萃取技术相结合,用于提取、分离与富集市售豆奶中的6种磺酰脲类农药残留。本法利用涡旋-超声协同乳化作用将离子液体完全分散在样液中,增大了离子液体与目标物的接触面积,降低了离子液体的用量,同时使用改性蒙脱土作为吸附材料,与离子液体结合使用,既降低了基质干扰,又能快速实现相分离。与其他方法相比,本方法具有萃取试剂用量少,萃取效率高,绿色环保,操作简单等优点,可用于市售包装豆奶中磺酰脲类除草剂的萃取与分析。