2015—2019年贵州省某三甲医院分离细菌的分布及对常用抗菌药物的耐药率变化*

张露丹， 周丹， 刘宝， 曹慧军， 费樱,***

(1.贵州医科大学 医学检验学院， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 临床检验中心， 贵州 贵阳 550004)

自1928年世界上第1种抗生素—青霉素被发现以来，抗菌药物与病原微生物之间的抗争从未停止[1]。虽然针对耐药菌的新药研发取得了较大的进展，但细菌通过产生药物灭活酶、钝化酶、药物作用靶位结构改变等耐药机制产生了各种多重耐药[2-3]。全国耐药监测网收集国内13所二级和36所三级医院临床分离菌药敏试验结果进行分析，由于不同地区不同医院抗菌药物使用不同，不同医院分离的主要细菌也不尽相同，细菌耐药性也存在很大差异[4-5]。贵州某三甲医院是集医疗、教学、科研及健康管理为一体的大型综合性医院，其细菌耐药形势有其自身的特点，动态监测细菌耐药性的变迁，防止耐药菌株的流行十分必要。因此，本研究选取该院2015—2019年细菌耐药监测数据，对检出的细菌分布和药敏结果进行分析，为医院管理部门制定相关控制措施和临床医生合理使用抗菌药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株来源 收集2015年1月1日—2019年12月31日医院不同标本分离的所有需氧菌(真菌、分枝杆菌除外)32 277株，标本来源包括呼吸道(n=14 462)、尿液(n=5 281)、伤口脓液(n=4 475)、血(n=3 540)、浆膜腔积液(n=1 438)、脑脊液(n=207)、生殖道(n=848)及其他(包括关节液、胆汁、胃液、活组织及乳汁等，n=2 026)。见表1。

1.1.2主要试剂与仪器 哥伦比亚血琼脂、嗜血杆菌巧克力琼脂、Muller Hinton琼脂、含血Muller Hinton琼脂、头孢硝噻吩纸片(郑州安图生物工程股份有限公司)，药敏纸片(英国OXOID公司)，多黏菌素B E-test检测条(温州市康泰生物科技有限公司)，MicroScan WalkAway SI 96 plus全自动细菌鉴定与药敏分析仪、Pos Combo Panel Type 33和Neg Urine Combo Panel Type 61药敏卡(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1细菌鉴定及药敏试验 采用全自动细菌鉴定与药敏分析仪进行细菌鉴定及药敏试验，细菌鉴定采用8进制计算法将28个生化反应转换成8位生物数码，计算机系统自动将这些生物数码与编码数据库进行比对获得相似系统鉴定值及菌种鉴定，部分苛养菌采用手工生化管辅助鉴定[6]；药敏试验采用最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)法、纸片扩散 (kindy-bauer, KB)法和E-test法，药敏结果判读参照临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI；2018版)M100-S28标准[7]，对替加环素的药敏判断标准≤2 mg/L为敏感，≥8 mg/L 耐药[8]。

1.2.2质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、流感嗜血杆菌ATCC49247、肺炎链球菌ATCC49619。

1.3 统计学分析

应用Whonet 5.6软件对细菌检出率和耐药率数据进行统计，使用SPSS 26软件进行统计学分析，定性资料采用频数(%)表示，检出率或耐药率的比较及年度线性变化趋势采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床分离细菌

共分离32 277株细菌，其中革兰阳性菌9 080株(占28.1%)，革兰阴性菌23 197 株(占71.9%)。革兰阴性菌居前5位的分别是大肠埃希菌(6 047株，18.7%)、克雷伯菌属(5 114 株，15.8%)、不动杆菌属(3 410株，10.6%)、铜绿假单胞菌(2 037株，6.3%)及肠杆菌属(1 793株，5.6%)，革兰阳性菌居前5位的分别是凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococcus，CNS，3 558株，11.0%)、金黄色葡萄球菌(2 425株，7.5%)、肠球菌属(2 405株，7.5%)、肺炎链球菌(251株，0.8%)及无乳链球菌(109株，0.3%)。见表1。

表1 2015—2019年贵州省某三甲医院临床标本分离细菌[n(%)]

2.2 分离细菌的标本来源

分离自临床的32 277株细菌，主要来源于呼吸道和尿液标本，分别占44.8%、16.4%，其次伤口脓液和血液标本占比也较高，分别占13.9%、11%，浆膜腔积液标本占4.4%，生殖道标本占2.6%，脑脊液标本占0.6%，其他标本占6.3%。

2.3 不同标本来源分离的细菌

呼吸道标本主要分离细菌为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌，泌尿道标本主要分离细菌为大肠埃希菌、屎肠球菌和肺炎克雷伯菌，伤口脓液标本主要分离细菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌，血标本主要分离细菌为CNS、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌。见表2。

表2 2015—2019年贵州省某三甲医院不同来源标本居前5位的细菌种类

2.4 革兰阳性菌药敏结果

2.4.1葡萄球菌属 2015—2019年 5年间金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林CNS(methicillin-resistant CNS，MRCNS)对利福平耐药率均呈下降趋势(P<0.032)，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitiveS.aureus，MSSA)对克林霉素耐药率也有下降趋势(P<0.001)；未检出对万古霉素耐药金黄色球菌，极少数MSSA对利奈唑胺耐药；未检出对万古霉素和利奈唑胺耐药的MRCNS，极少数MRCNS对万古霉素和利奈唑胺耐药，葡萄球菌属对奎奴普丁或达福普汀耐药率<2.7%；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(meticillin-resistantS.aureus，MRSA)和MRCNS对青霉素G、庆大霉素、利福平、氟喹诺酮类抗生素、复方新诺明、克林霉素、红霉素、奎奴普丁或达福普汀及四环素的耐药率明显>MSSA和MSCNS(P<0.002)。见表3和表4。

表3 2015—2019年贵州省某三甲医院金黄色葡萄球菌对常见抗菌药物的耐药率

表4 2015—2019年贵州省某三甲医院CNS对常见抗菌药物的耐药性

2.4.2肠球菌属 2015—2019年粪肠球菌对所监测抗菌药物的耐药率无明显变化，粪肠球菌对利奈唑胺、万古霉素耐药率分别<2.1%和0.7%；屎肠球菌对高浓度庆大霉素、高浓度链霉素、利福平、环丙沙星、呋喃妥因的耐药率有下降趋势(P<0.03)；未检出对利奈唑胺耐药的屎肠球菌，对万古霉素耐药率小于0.4%，屎肠球菌对奎奴普丁/达福普汀耐药率为10.8%。屎肠球菌对青霉素、氨苄西林、高浓度庆大霉素、高浓度链霉素、利福平、氟喹诺酮类抗菌药物、红霉素、呋喃妥因的耐药率>粪肠球菌(P<0.001)，粪肠球菌对四环素的耐药率高于屎肠球菌(P<0.001)。见表5。

表5 2015—2019年贵州省某三甲医院粪肠球菌和屎肠球菌对常见抗菌药物的耐药率

2.4.3链球菌属 β溶血性链球菌对青霉素耐药率较低(<2%)，对头孢曲松、头孢噻肟、利奈唑胺、万古霉素保持高度敏感耐药率均为0%，对红霉素、克林霉素的耐药率较高(>60%)。肺炎链球菌主要分离自非脑脊液标本，对红霉素、克林霉素耐药率>90%，对阿莫西林、左氧氟沙星相对敏感，耐药率<6.4%，未检测出耐利奈唑胺和万古霉素的链球菌属细菌。

2.5 革兰阴性菌药敏结果

2.5.1肠杆菌科细菌 2015—2019年大肠埃希菌对青霉素类、头孢菌素类(除头孢他啶)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、四环素耐药率均>60%，对氨曲南、氟喹诺酮类药物耐药率在50%左右，对氨基糖苷类抗生素耐药率也在40%左右，均高于肺炎克雷伯菌(P<0.001)，但对头孢菌素类、氨曲南、氨基糖苷类、四环素有下降趋势(P<0.04)；对β-内酰胺类-酶抑制剂合剂(除氨苄西林/舒巴坦)耐药率<10%，低于肺炎克雷伯菌(P<0.001)，对碳青霉烯类、阿米卡星的耐药率较低(<2.4%)，未检出对替加环素耐药的大肠埃希菌；2015—2019年肺炎克雷伯菌对头孢菌素类(除头孢他啶)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药率大于40%，对β-内酰胺类-酶抑制剂合剂(除氨苄西林/舒巴坦)、氟喹诺酮类抗生素耐药率为20%左右，5年间有增长趋势(P<0.005)；对碳青霉烯类、阿米卡星的耐药率在10%左右，>大肠埃希菌(P<0.001)，且5年间有增长趋势(P<0.001)；对替加环素耐药率为0.3%，5年间有下降趋势。见表6。

表6 2015—2019年贵州省某三甲医院大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对常见抗菌药物的耐药率

2.5.2非发酵革兰阴性菌 2015—2019年铜绿假单胞菌对头孢菌素类(除头孢他啶)、哌拉西林/他唑巴坦、碳青霉烯类、氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、氟喹诺酮类耐药率在10%～25%之间，且对后4种抗生素5年间耐药率有下降趋势(P<0.03)，对头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星耐药率较低，分别为10%和5%左右，但五年间对头孢哌酮/舒巴坦耐药率有升高趋势(P=0.048)。2015—2019年鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、氨曲南、碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素及甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药率菌均>65%，>铜绿假单胞菌(P<0.001)，且5年间有增长趋势，差异有统计学意义(P<0.014)，未检出对替加环素耐药的鲍曼不动杆菌。见表7。

表7 2015—2019年贵州省某三甲医院铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌对常见抗菌药物的耐药率

2.5.3其他革兰阴性杆菌 流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率>55%，对亚胺培南、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦高度敏感，但3种抗生素均已经出现非敏感菌株，不敏感率2.7%～4.8%；环丙沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素、头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟及氨曲南均出现较高的不敏感率，不敏感率15.6%～34%。

2.6 多重耐药菌检出情况

多重耐药菌检出结果显示，2015—2019年MRSA、MRCNS、耐万古霉素肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)、耐碳青霉烯大肠埃希菌(carbapenem-resistantE.coli，CRECO)和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(carbapenem-resistantPseudomonasaeruginosa，CRPA)的检出率无明显的增减趋势，其5年平均检出率分别为29.1%、84.1%、0.2%、1.0%及28.0%；而5年间耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantklebsiellapneumoniae，CRKP)和耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)的检出率逐年明显上升(P<0.001，表8)。重症监护病房(intensive care unit，ICU)居监测七种多重耐药菌检出科室的首位，神经内科和神经外科为CRKP、CRPA及CRAB检出科室的第2位或第3位。见表9。

表8 2015—2019年贵州省某三甲医院多重耐药菌检出率

表9 贵州省2015—2019年某三甲医院不同多重耐药菌居前5位的科室

3 讨论

本研究中5年间临床分离细菌的菌株总数、革兰阳性或阴性菌比例和分离居前5位细菌与2019年中国细菌耐药监测网(China antimicrobial surveillance network, CHINET)三级医院细菌耐药监测和中南大学附属医院细菌耐药监测数据基本一致[4，9]。临床分离菌株标本来源第1位为呼吸道标本(44.8%)高于中南大学附属医院(39.3%)和武汉同济医院(34.6%)，而血液标本位于尿液、伤口脓液标本之后居第4位[9-10]。虽然临床微生物实验室通过向临床科室宣教鼓励送检更有意义的血液等无菌体液标本，但送检率仍处于较低水平。血液标本分离株中CNS占36.9%，略高于全国平均水平[11]。有报道指出CNS血培养阳性仅12%～26%被诊断为血流感染[12]，CNS作为条件致病菌，由于免疫抑制剂、化疗药物的应用以及侵袭性的诊疗操作，使其在医院感染病原菌中所占比例越来越高。采血过程中未严格无菌操作也会引起污染，因此需多次送检血培养，同时结合病史、其它实验室检查(白细胞计数、C-反应蛋白、降钙素等)、血培养阳性套数及血培养报阳时间等因素综合分析。

2015—2019年5年间金黄色葡萄球菌对利福平耐药率逐年下降，利福平耐药与rpoB基因突变密切相关，而且在rpoB基因突变的过程中利福平是主要的选择性压力[13]，故本研究中利福平耐药率逐年下降可能与环境中的利福平暴露减少相关。VRE在不同国家地区的检出率不同，与其他国家和地区相比，国内VRE检出率仍较低[14-15]。VRE通常都以万古霉素耐药屎肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcusfaecium，VREfm)为主，本研究中VREfm维持在较低水平且无明显变化趋势，与2008—2017年CHINET肠球菌属耐药性监测报告VREfm检出率1.2%大致相同[16]。肠球菌球菌中最常检出的耐万古霉素基因是vanA和vanB[17]，国内外分子流行病学研究发现大多数引起人类感染的VRE是 CC17 克隆群屎肠球菌，除对万古霉素耐药外，还对氨苄西林、高浓度氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物耐药，而且这些菌株通常携带有esp毒力基因[18]。

本研究中大肠埃希菌对青霉素类、头孢菌素类(除头孢他啶)、氨曲南的耐药率>50%，且均>其他肠杆菌科细菌，提示其产ESBLs或AmpC的比例高于其他肠杆菌科细菌[10]。欧洲的耐药菌感染所致死亡率调查研究结果发现，第3代头孢菌素耐药大肠埃希菌是引起感染死亡最多的病原菌[19]，故微生物实验室中对于产ESBLs或AmpC大肠埃希菌的及时检出对于指导临床针对性用药，从而降低病死率十分重要。碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistantenterobacteriaceae，CRE)的流行播散造成了医疗保障体系沉重的负担。由于碳青霉烯类耐药菌株往往对其他临床常用抗菌药物也耐药，使临床的抗感染治疗面临无药可用的困境，进而导致其所致感染的高病死率[20]。根据全国耐药监测数据CRE中CRKP占到72.4%[4]，本院5年间CRKP检出率明显增加，增长趋势与国内相关报道[21]一致，主要来于ICU、神经外科、神经内科，这些病区的病人大多为免疫力低下的老年人或处于无意识状态，而且使用侵入性医疗设备[22]。据文献报道，神经外科11例CRKP感染患者中7例证实为医院感染，患者环境物体表面和部分医务人员手、咽拭子检出CRKP[23]。因此，CRKP存在医院染暴发可能，通过CRKP感染患者的病原体污染环境和医务人员的手导致感染的传播。文献报道，住院患者抗菌药物的使用，尤其是广谱头孢菌素的使用与肺炎克雷伯菌的耐药存在相关性，ICU病房中CRKP的检出碳青霉烯类抗生素的使用是独立的危险因素[24]。

鲍曼不动杆菌是引起医院感染的常见致病菌[6]，近年来鲍曼不动杆菌呈上升趋势已成为非发酵菌的感染中第一位的细菌[9-10]。本院鲍曼不动杆菌对3、4代头孢菌素类、亚胺培南耐药率逐年上升，多重耐药不动杆菌常存在染色体编码的β-内酰胺酶，包括C类头孢菌素酶、D类苯唑西林酶及质粒介导的A类β-内酰胺酶[25]。2015—2019年5年间鲍曼不动杆菌氨基糖苷类抗生素的耐药率也逐年上升，16SrRNA甲基化酶是介导高水平氨基糖苷类抗生素耐药的机制，armA和rmtB是主要基因[26]，奚俊等[27]报道armA在鲍曼不动杆菌广泛存在。铜绿假单胞菌除了天然耐药外，对其他类抗菌药物的耐药率均在30%左右及以下，需要对铜绿假单胞菌的耐药性持续关注。

在应对多重耐药菌的威胁时，只有坚持以预防感染为中心，抗菌药物管理和医院感染管理两手抓两手硬[28]。细菌耐药监测工作必要坚持不懈，并加提高数据分析的能力，以及时反映医院和地区的耐药菌流行情况和变化趋势，为医院管理者制定感染控制政策提供参考，为医生经验性使用抗菌药物提供依据。