荔波唇柱苣苔黑斑病病原菌鉴定

朱佳敏 付 莉 吴跃开 张 序

(1.贵州省核桃研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005；3.修文县谷堡镇林业站，贵州 修文 550213)

荔波唇柱苣苔(Chiritaliboensis)属苦苣苔科唇柱苣苔属多年生草本植物，为贵州特有，仅产于荔波县境内，其花色彩艳丽，叶形叶色较好，观赏价值很高，可作盆栽花卉、园林绿化植物等[1-2]。作为新开发的花卉品种，目前对其研究方向多集中在扦插繁殖技术等方面[3-4]；随着人工规模化栽培，荔波唇柱苣苔病虫害问题日益突显，其中表现最严重的就是黑斑病。该病主要危害荔波唇柱苣苔的叶片，感病后感病部位会产生黑褐色的病斑，严重时病斑遍布整个叶片，造成叶片焦枯、卷曲，甚至整株枯死。目前，荔波唇柱苣苔黑斑病的病原尚未明了，相关研究还是空白。有鉴于此，本文通过形态学及分子生物学手段对荔波唇柱苣苔黑斑病的致病病原菌进行了鉴定，以期为今后的病害防治工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分离材料：病原分离材料采自贵州省贵阳市惠水县苗圃基地发病的荔波唇柱苣苔植株。

采集时间：2019年6月。

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，121℃ 灭菌30min。

试剂-及仪器：PCR扩增试剂盒、DNA提取试剂盒、引物ITS1/ITS4(均购于生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 荔波唇柱苣苔黑斑病发病症状观察

在苗圃中对荔波唇柱苣苔感病植株进行详细观察，记录病害危害状况、危害部位、危害症状等；室内在解剖镜下观察病斑上是否存在相关病征(子实体)。

1.3 病原菌的分离和纯化

采用常规组织分离法分离病叶。采集的新鲜病叶用清水冲洗干净，再用75%乙醇消毒10min，用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干多余水分。在超净工作台上对组织进行分离，从病健交界处切取5mm×5mm的组织块于PDA培养基上，28℃生化培养箱培养7d，待菌丝长出后用接种环挑取边缘菌丝转接至新的PDA平板上，直至出现单一菌落，观察记录生长相似的菌落形态及颜色。将分离得到的菌落进一步纯化，并将菌落接种PDA斜面培养基上培养，于4℃冰箱中保存备用。

1.4 病原菌的致病性鉴定

分离得到菌落形态相似的菌株8株，随机选择菌株LBJT1、LBJT3、LBJT4进行致病性验证。将各测试菌株在PDA培养基上培养9d，培养出分生孢子(图2，F)，用无菌水冲洗分生孢子，将孢子配制成107个/mL的悬液。采集新鲜健康的荔波唇柱苣苔12株，每个处理3株，设无菌水为空白对照3株，接种时，先将植株叶片清洗干净后用75%乙醇消毒，然后用无菌水冲洗；用无菌接种针刺伤叶片，每株叶片3个伤口，将制好的孢子悬液用移液枪注入孔内。对照也采用相同方法，所有的处理植株置于室内培养，定期观察记录发病情况，待发病后从发病组织处再次分离纯化病原菌，验证感病菌与原接种菌是否一致。

1.5 病原菌形态学观察

1.5.1 病叶上病原菌形态观察

将发病的叶片进行保湿培养一周后，在解剖镜及显微镜下观察病斑上是否有病原菌的菌体结构，包括分生孢子梗、分生孢子等的形态特征，并测量其大小。

1.5.2 培养形状观察

将分离纯化的病原菌转接到PDA平板上，28℃培养5～10天后观察菌落形态学特征。可先肉眼观察形态特征，然后在显微镜下观察分生孢子的形态并测量其大小。参阅相关专著《真菌分类学》[5]、《中国真菌志》[6]，对病原菌进行形态学鉴定。

1.6 病原菌 rDNA-ITS的PCR扩增与序列

用真菌DNA提取试剂盒(上海生工)对病原菌的总DNA进行提取，并用通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC进行PCR扩增，25μL反应体系：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL、10mM dNTP0.5μL、10μM引物各0.5μL、模板DNA1μL、Taq酶0.3μL、加ddH2O至总体积25μL；反应条件：94℃预变性2min、94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环。得到的PCR产物经纯化切胶回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上利用BLAST与GenBank上已经发表的基因进行同源性对比，并与GenBank中已登录代表性菌株进行系统发育分析，用MEGA6.0系统发育软件构建系统发育树，进而确定其系统发育关系。

2 结果与分析

2.1 荔波唇柱苣苔黑斑病症状观察

调查结果表明，大棚中荔波唇柱苣苔小苗和大苗都易感染黑斑病，感病株率达90%，感病指数达56.25。病菌常从叶缘开始侵染并逐渐向内扩展成不规则的大型病斑；病菌亦可从叶中间位置开始侵染，这种情况下病斑常呈环状。病斑褐色至深褐色，常具波纹或轮纹，边缘具黄色晕圈(如图1)。随着病程的不断发展，病斑最终可扩散至全叶，导致叶片枯死，甚至全株枯亡。保湿条件下，病斑上可见长出灰黑色的绒毛，此即为病原菌的分生孢子梗及分生孢子(如图2-E)。

图1 荔波唇柱苣苔黑斑病感病植株症状

2.2 病原菌的培养特征

对病株的病健交界处进行组织分离，获得8个纯培养菌株，其菌落形态与生长速度基本一致，菌落圆形，初为白色绒毛状，边缘整齐，后菌落内圈颜色加深，正面灰褐色，背面褐色，并呈现明显的环状轮纹，分生孢子梗单生，淡褐色，屈膝状弯曲，具隔膜。分生孢子链分支，分生孢子短链生，倒棍棒形，卵形或近椭圆形，淡褐色，表面光滑，具3～7个横膈膜，大小为18.32～61.37μm×8.44～19.18 μm，短喙柱状，淡褐色，长为2.70 μm～28.38 μm(图2)。综合上述特点，将病原菌鉴定为Alternariaalternata。

A:PDA培养基菌落正面；B:PDA培养基菌落背面

2.3 病原菌的致病性测定

选择菌株LBJT1、LBJT3、LBJT4进行接种实验，接种7d后，60%的伤口处出现半径约0.1cm的褐色圆形；14d后，75%的伤口处均为直径0.5cm的褐色斑纹，形成不规则的水渍状病斑(图2，G)，感病率为75%，清水对照的植株无发病症状(图2，H)。分离并纯化感病组织的病原物，得到与原菌株相同的病原菌。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

以菌株LBJT1和LBJT2的DNA为模板，用真菌的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，将PCR产物送去测序，把测序的序列提交到NCBI上进行同源性比对，得到分离的菌株与(MG890315Alternariaalternata)的同源性为99%，并从Genbank上下载相关序列进行系统发育树的研究。通过进一步的系统进化树聚类分析(图3)，可以看出进化树分为两枝，一枝为链格孢属的，另一枝为外群葡萄座腔菌属，供试菌株 LBJT1和LBJT2与Alternariaalternata均聚为一簇，所以进一步证实分离的菌株为Alternariaalternata。

图3 使用邻位连接法基于ITS序列的系统发育树

3 结论与讨论

从具有典型病症的病株上分离病原菌，经过形态学观察和rDNA-ITS序列比对、致病性接种试验等研究结果的综合分析，明确了引起荔波唇柱苣苔黑斑病的病原菌为细交链孢菌(Alternariaalternata(Fr.)Keissler)。此前，相关研究表明该病原菌能引起多种植物的黑斑病，如月季、蓝莓、核桃、牡丹、生菜、三七、大豆、樱桃等[7-14]，这是首次在荔波唇柱苣苔上发现该病原菌，通过此次黑斑病病原菌的准确鉴定，可为该病害以后的防治提供可靠的依据。