黄芪对体外培养的新生大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡的保护机理研究

谢耀锟 曹金城 周锦魁

脑梗死和脑出血都存在缺氧和缺血的病理过程,随着研究的深入,发现该过程中还存在细胞凋亡［1］。研究显示［2］,脑动脉硬化导致的脑组织细胞缺氧和缺血是因细胞凋亡引起,所以凋亡在其中扮演重要角色。研究显示［3］,黄芪提取物可有效抗缺氧神经细胞凋亡,本研究就分析中药黄芪在对抗神经细胞缺氧性凋亡中的作用机理,皆在为指导临床使用黄芪治疗脑梗死和脑出血等提供理论依据,现报告如下。

1 资料与方法

1.1材料 清洁级SD 大鼠(南京君科生物工程有限公司,货号：J001)10 只；氮气/二氧化碳(N2/CO2)空气混合器、缺氧罐(广州市旭朗机械设备有限公司,型号：PE-180F)；抗兔IgG 二抗SABC 试剂盒(上海群已生物科技有限公司,货号：PAB10816)；Bax 多克隆抗体(艾美捷科技有限公司,货号：PAB27023)；D-Hank’s液(北京百奥莱博科技有限公司,货号：BL0817)；兔抗大鼠Bcl(北京百奥莱博科技有限公司,产品编号：YT684)；Neurobasal 培养液(赛默飞世尔科技有限公司,货号：21103-049)；黄芪注射液(神威药业集团有限公司,批号：0011024)；B27Neurobasal 培养液(上海意杰生物科技有限公司,批号：N014B)；多聚甲醛(PA)(武汉赛维尔生物科技有限公司)；光学显微镜(上海普赫光电科技有限公司,型号：E100)；荧光显微镜(上海光学仪器厂,型号：XSP-BM13C)；新生牛血清(北京索莱宝科技有限公司,货号：S9040)；马血清(上海北诺生物有限公司型号：Hyclone SH30074.03)。

1.2方法

1.2.1大脑皮层神经细胞原代无血清培养 取出大鼠大脑,置于含有氯化钠 6.25 mmol/L 的D-Hank’s 液中,软脑膜剥除,将皮层分离,洗3 次。皮层组织剪为1～2 mm3小块,置于D-Hank’s 液中(温度37℃,含0.125%胰蛋白酶),水浴25 min 后加入10%新生牛血清将反应终止,1000 r/min 离心3 min,去除上清液,再加入含6.25 mmol/L 氯化钠的5 ml 10%马血清打散,放置5 min 后取细胞悬液置于第2 支离心管,重复1 次上述步骤。10%马血清清洗细胞2 次,接种于24 孔培养板(5×105/ml),各孔0.4 ml,置于37 ℃,5%的CO2饱和湿度培养4 h。再换为含氯化钠 6.25 mmol/L 的2%B27Neurobasal 培养液,各孔0.3 ml,后续每3 天换液1 次。

1.2.2大脑皮层神经细胞缺氧复氧培养 神经细胞培养4 d 后置入厌氧罐,通入95%的N2和5%CO2混合气体,1500 ml/min,30 min 后将厌氧罐夹闭。将厌氧罐置入37℃培养箱中培养,再取出24 孔培养板,置于5%的CO2,于37℃培养箱进行复氧培养。

1.2.3台盼蓝染色细胞直接计数法 24 孔培养板缺氧复氧培养后,1∶9 比例加入0.4%台盼蓝,将其浓度降为0.04%,染色1 min,将盖玻片反盖于载玻片,于光学显微镜下记录活细胞和死细胞数,随机计数＞200 个细胞,计算存活率。

1.2.4神经细胞Hoeehst33342 染色 神经细胞加入Hoeehst33342 10 μg/ml,37℃环境下孵育30 min,加入1%的PA 固定10 min,然后用封液将盖玻片封于载玻片,使用荧光显微镜观看。

1.2.5神经细胞Bax 和Bcl-2 免疫组化染色 神经细胞去除培养液,使用磷酸缓冲盐溶液0.01 mol/L 冲洗1 次,4%多聚甲醛固定液固定20 min,磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次,5 min/次。0.1% Triton-X100 PRS 作用15 min,磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次,0.3%过氧化氢处理20 min,磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次,加入10%小牛血清磷酸缓冲盐溶液封闭。加入抗Bax 或抗Bcl-2,4℃湿盒过夜,次日使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次,10 min/次,加入抗兔IgG 二抗SABC,37℃下静置45 min,磷酸缓冲盐溶液冲洗3 次。加入A、B 试剂,37℃下静置45 min,磷酸缓冲盐溶液冲洗3次,给予3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色将反应终止,磷酸缓冲盐溶液冲洗3次,最后封片。

1.2.6实验分组 ①黄芪注射液组：缺氧培养前分别加入黄芪生药量10、50、100 mg/ml 作为黄芪注射液1 组、2 组、3 组；Hoeehst33342 染色中,黄芪注射液2 组再加1 组作为第4 组,缺氧培养12 h 后加入黄芪注射液50 mg/ml。②脑源性神经营养因子组：缺氧培养前加入脑源性神经营养因子50 ng/ml；Hoeehst33342染色中,再加1 组作为第2 组,缺氧培养12 h 后加入脑源性神经营养因子50 ng/ml。③凋亡阳性组：缺氧复氧下培养。④正常对照组：5%的CO2,于37℃饱和湿度下培养。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1不同缺氧时间对培养大脑皮层神经细胞存活率的影响比较 神经细胞培养4 d 后置入厌氧罐,分别缺氧6、12、24 h,均复氧48 h,结果显示,各组细胞存活率呈持续下降趋势,正常对照组＞缺氧6 h 组＞缺氧12 h 组＞缺氧24 h 组,差异有统计学意义(t=4.9775、14.2281、69.7896,P＜0.05)。见表1。

表1 不同缺氧时间对培养大脑皮层神经细胞存活率的影响比较()

表1 不同缺氧时间对培养大脑皮层神经细胞存活率的影响比较()

注：与正常对照组比较,aP＜0.05

2.2黄芪缺氧诱导大脑皮层神经细胞凋亡的Hoeehst33342 染色结果 神经细胞培养4 d 后缺氧12 h再复氧48 h,进行Hoeehst33342 染色,黄芪注射液1、2、3 组的细胞凋亡率呈持续降低趋势,细胞凋亡率黄芪注射液1 组＞黄芪注射液2 组＞黄芪注射液3 组,差异有统计学意义(t=3.9112、13.5405,P＜0.05)；黄芪注射液4 组的细胞凋亡率高于黄芪注射液2 组,差异有统计学意义(t=10.3122,P＜0.05)。见表2。

表2 黄芪缺氧诱导大脑皮层神经细胞凋亡的Hoeehst33342 染色结果比较()

表2 黄芪缺氧诱导大脑皮层神经细胞凋亡的Hoeehst33342 染色结果比较()

注：与凋亡阳性组比较,aP＜0.05

2.3黄芪对缺氧诱导大脑皮层神经细胞凋亡调控基因蛋白的影响 神经细胞培养4 d后缺氧12 h再复氧48 h,各组Bax 和Bcl-2 蛋白表达：黄芪注射液1、2、3 组Bax 蛋白表达随着黄芪注射液的增加而降低,Bcl-2 蛋白表达随着黄芪注射液的增加而增加；黄芪注射液1 组Bax 表达高于黄芪注射液3 组,Bcl-2 蛋白表达低于黄芪注射液3 组,差异有统计学意义(t=5.2528、3.5631,P＜0.05)。见表3。

表3 黄芪对缺氧诱导大脑皮层神经细胞凋亡调控基因蛋白的影响比较()

表3 黄芪对缺氧诱导大脑皮层神经细胞凋亡调控基因蛋白的影响比较()

注：与凋亡阳性组比较,aP＜0.05

2.4黄芪对缺氧诱导大脑皮层神经细胞表达Bcl-2/Bax比值的影响 缺氧诱导大脑皮层神经细胞Bax 提高,Bcl-2 降低,黄芪注射液1、2、3 组Bcl-2/Bax 比值黄芪注射液1 组＜黄芪注射液2 组＜黄芪注射液3 组,差异有统计学意义(t=1.8974、13.1559,P＜0.05)。黄芪注射液1、2、3 组Bcl-2/Bax 比值均明显高于凋亡阳性组,差异有统计学意义(t=20.6836、25.2982、38.8909,P＜0.05)。见表4。

表4 黄芪对缺氧诱导大脑皮层神经细胞表达Bcl-2/Bax 比值的影响比较()

表4 黄芪对缺氧诱导大脑皮层神经细胞表达Bcl-2/Bax 比值的影响比较()

注：与凋亡阳性组比较,aP＜0.05

3 讨论

大量研究表明［4,5］,细胞凋亡为导致脑梗死、脑出血等脑细胞死亡的一个重要途径。本研究通过含糖缺氧和复氧培养发现,细胞存活率中,正常对照组＞缺氧6 h 组＞缺氧12 h 组＞缺氧24 h 组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结果提示缺氧既有细胞凋亡,也有细胞坏死,因此选择缺氧12 h 进行后续实验较合适。有研究通过无糖缺氧3、5 h 和复氧45、24 h 发现,大鼠40%的海马神经元凋亡,提示有糖培养下,因此存在糖酵解,所以缺氧时间需要更长才会紊乱神经细胞代谢,但机体为有糖环境,因此选择含糖培养基进行培养较为符合［6］。研究表明［7］,黄芪总皂甙可提高脑缺血再灌注损伤脑部血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,对自由基产生进行抑制,有效降低或避免神经细胞凋亡。黄芪注射液包含氨基酸、多糖、皂甙等多种黄芪有效成分,本研究通过将其作用于缺氧培养的生精细胞,再使用Hoeehst33342 染色观察,发现缺氧前加入黄芪注射液能显著抑制缺氧导致的神经细胞凋亡,缺氧12 h 后加入黄芪注射液,虽然抑制细胞凋亡的作用有所降低,但也明显低于凋亡阳性组,差异有统计学意义(P＜0.05),证实了黄芪注射液可抑制缺氧性神经细胞凋亡。Bax 和Bcl-2 是凋亡调控基因Bcl-2 家族中备受关注的基因和蛋白,Bax-Bax 蛋白二聚体可促进凋亡,Bcl-2-Bax 可抑制凋亡,所以Bax 和Bcl 蛋白的表达量很关键。有研究对脑梗死大鼠脑内导入Bcl-2 基因,促进Bcl-2 蛋白过量表达,结果发现其能明显减轻脑梗死程度［8］。本研究结果显示,黄芪注射液1、2、3组Bax 蛋白表达随着黄芪注射液的增加而降低,Bcl-2蛋白表达随着黄芪注射液的增加而增加,黄芪注射液1、2、3 组Bcl-2/Bax 比值均高于凋亡阳性组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

综上所述,黄芪注射液可有效通过提升Bcl-2/Bax比值来调节缺氧神经细胞避免凋亡。