超声波辅助纤维素酶法提取绣球菌多糖

冯立国 陈湘莲 徐 宁 黄晓辉*

（1 湖南省食用菌研究所，湖南长沙 410013；2 湖南医药学院，湖南怀化 418000）

绣球菌〔Sparassis crispa（Wulfen）Fr.〕隶属于真菌界担子菌门异隔担子菌纲非褶孔菌目绣球菌科（李传华 等，2013），是一种食药兼具的菌类，在日本非常受欢迎（Kimura，2013）。绣球菌的葡聚糖含量超过40%，研究表明，每日按照1 000 mg ·kg-1体重口服绣球菌多糖可以有效改善糖尿病小鼠的伤口愈合不良情况（Kwon et al.，2009）；口服绣球菌多糖能增强环磷酰胺（CY）诱导的白细胞减少症小鼠的造血反应（Ohno et al.，2002）；绣球菌多糖对前列腺癌细胞系具有抗癌活性（Bekci et al.，2019）；对小鼠进行绣球菌多糖喂养，可显著降低小鼠小肠和血浆中的TNF-a 水平（Uchida et al.，2019）。可见，绣球菌多糖极具医疗和保健功效，并且多糖制备过程相对环保，对绣球菌中特有的活性多糖进行研究非常具有价值和意义。

近几年，采用超声辅助提取多糖的研究较多，多糖得率显著提高。陈程等（2018）利用超声辅助酶法提取牡丹籽饼中的多糖，在最佳工艺条件下，牡丹籽饼中多糖提取量为196.87 mg · g-1。陈金娥等（2018）采用响应面法优化超声波提取三七根多糖，多糖得率达到19.51%。Zhang 等（2020）通过响应面法优化了超声辅助酶提取技术提取绣球菌多糖，产率高达14.63%，与传统的热水提取（HWE）方法相比提高了68.54%。绣球菌的多糖主要集中在细胞壁，湖南省食用菌研究所保鲜加工课题组利用超声辅助纤维素酶进行绣球菌多糖的提取，通过超声的机械效应和空化效应能有效破裂植物细胞壁，同时辅助纤维素酶的降解作用，加速多糖的析出，并利用响应面法对提取条件进一步优化，确定了绣球菌多糖提取的参数，进一步提高了绣球菌多糖的得率。

1 材料与方法

1.1 材料

参试绣球菌在市场中采购，将新鲜绣球菌置于烘箱中70 ℃烘干至恒重，粉碎至200 目备用。

主要仪器包括T6 新世纪分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SCIENTZ-ⅡD 超声波粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），最大功率950 W；数字式研磨仪〔维根技术（北京）有限公司〕；长城DL-400 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）。

主要试剂包括浓硫酸、苯酚（上海国药集团化学试剂有限公司），氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司），葡萄糖标准样品、纤维素酶（上海源叶生物科技有限公司），无水乙醇（天津富宇精细化工有限公司），柠檬酸（天津大茂化学试剂厂）。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取方法 准确称取绣球菌干粉5 g，加入配制好的纤维素酶液，再加入超纯水进行料液比配置，按照设定值进行超声提取，完成后迅速放入100 ℃的水浴中灭活10 min；然后10 000 r ·min-1离心10 min，取上清液作为待测液。

1.2.2 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸比色法测定提取液中的多糖含量（徐光域 等，2005），经预试验确定待测液稀释20 倍作为待测样品，吸取1.0 mL 待测样品按下式计算多糖得率。

可溶性多糖得率=（C×V×N）/（X×M× 103）× 100%

式中，C为通过标准曲线查得多糖的质量浓度（mg · mL-1）；V为提取液的体积；N为提取液稀释倍数（20 倍）；M为绣球菌粉质量（5 g）；X为测定样品的体积（1 mL）；

1.2.3 单因素试验 共考虑5 个因素对多糖提取率的影响，各因素浓度梯度见表1，进行单个因素试验时，其他因素取其梯度方案中的中位数。每个梯度3 次重复，采用DPS 7.05 软件进行单因素方差分析（LSD 法）。

表1 单因素试验设计方案

1.2.4 响应面设计 在单因素试验结果基础上，确定纤维素酶添加量为3%，超声功率570 W，利用Design-Expert 11.04 软件，采用Box-Behnken 设计方案，以料液比A（50 g · mL-1）、提取温度B（50℃）和超声时间C（70 min）为0 点值进行编码，共设计17 个试验点，其中5 个中心复合点，12 个析因点。通过软件拟合得到二次方程及预测最佳条件。

1.2.5 最佳提取条件 称取5 g 绣球菌干粉，按照预测最佳条件进行3 次重复试验，取均值验证。称取50 g 绣球菌干粉，按照预测最佳条件进行多糖提取，对离心后的溶出液进行含量测定；收集滤渣，再次按照最佳提取条件进行多糖提取，离心收集溶出液并再次进行含量测定；收集2 次的溶出液，采用旋转蒸发仪浓缩至100 mL，加入400 mL 无水乙醇至80%浓度，置于4 ℃冰箱冷藏过夜，离心得到沉淀即为绣球菌粗多糖。

1.2.6 分离与纯化 精密称取绣球菌粗多糖2 g，加双蒸水40 mL 配成5%的粗多糖液，采用Sevage法去除蛋白。去除蛋白后的粗多糖液用30%的氨水调至pH 为8.0，逐滴添加20% H2O2至溶液为浅黄色，50 ℃水浴保温2 h，绣球菌粗多糖基本呈透明色，10 000 r · min-1离心10 min 后装入3 500 D（道尔顿）透析袋，每隔12 h 换水1 次，透析2 d。将透析袋中的液体取出，水浴浓缩至10 mL，加入4 倍体积无水乙醇沉淀过夜，10 000 r · min-1离心10 min 取沉淀，沉淀经无水乙醇、无水乙醚多次洗涤后，得到纯度较高的多糖，采用苯酚硫酸法测定多糖含量。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖含量分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg · mL-1，吸光度值为0、0.23、0.48、0.75、0.95、1.28，经函数关系式y=12.614x-0.015 7，R2=0.996，线性关系良好，可用作标准曲线。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 不同料液比对绣球菌多糖得率的影响20～60 g · mL-1料液比梯度下绣球菌多糖提取率依次是14.29%、15.06%、16.51%、18.21%、19.84%。结果表明，料液比对绣球菌多糖得率有着较为显著的影响，多糖得率随料液增加不断增加，未找到料液比与多糖得率的拐点。将料液比确定为响应面试验的交互因素之一。

2.2.2 不同提取温度对绣球菌多糖得率的影响30～70 ℃提取温度梯度下绣球菌多糖提取率依 次 是20.14%、20.75%、16.71%、13.54%、14.56%。随着提取温度升高，多糖得率总体表现降低趋势，与蒋孟如等（2016）未添加相关酶的试验结果刚好相反。原因可能是在酶加入的条件下，温度升高，酶的活性丧失导致多糖得率降低，因此在添加相关酶的条件下，后期响应面试验设计中应控制超声功率和温度。

2.2.3 不同超声时间对绣球菌多糖得率的影响20～80 min 超声时间梯度下绣球菌多糖提取率依次是13.29%、14.11%、14.58%、15.41%、18.70%、19.00%、19.88%。结果表明，随着超声时间的加长，多糖得率明显增加，将超声时间确定为响应面交互因素之一。

2.2.4 不同超声功率对绣球菌多糖得率的影响190～665 W 超声功率梯度下绣球菌多糖提取率依次是11.70%、12.73%、14.55%、16.32%、19.86%、17.67%。随着超声功率的提高，多糖得率有较大的提升，在超声功率570 W 时出现了拐点，因此，不将超声功率作为交互因素。

2.2.5 纤维素酶添加量对多糖得率的影响 1%～5%纤维素酶浓度梯度下绣球菌多糖提取率依次是13.54%、16.20%、16.61%、16.67%、16.82%。在纤维素酶添加量为3%时，增加酶添加量对多糖得率影响不大，因此不将酶添加量作为交互因素。

2.3 响应面试验结果

按照1.2.1 多糖提取步骤，酶添加量为3%，超声功率570 W，按照软件设计的3 因子3 水平共计17 个试验点，试验结果见表2。运用Design-Expert 11.04 软件对表2 的试验结果进行分析，得到绣球菌多糖得率（Y）对料液比（A）、酶添加量（B）和超声时间（C）的二次多项回归方程为：Y=23.07+1.64A+0.569B -0.746 9C -0.055AB -0.035AC+0.098BC -0.03A2+0.287B2-1.32C²。回归模型的方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken 设计方案与试验结果

从回归模型方差分析结果可以看出（表3）：该模型P＜0.01，失拟项＞0.05，模型显著，说明模型与数据之间拟合度好，可以用此模型及因素预测多糖的提取效率，并且模型试验数据可靠。

表3 回归模型方差分析结果

从模型中各因素的P值可以判断，因素A、B、C、BC、B2、C2（P＜0.01）对模型影响极显著；因素AB（P＜0.05）对模型影响显著；因素AC（P≥0.05）交互影响不显著。从各因素的F值判断，各因素对多糖得率影响的强弱次序为：A（料液比）＞C（提取温度）＞B（超声时间）。该模型的复相关系数R2=0.999 7，说明试验误差小。因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

2.4 3 个因素交互作用对多糖提取率的等高线和响应面

料液比和超声时间两个因素交互作用下的P=0.035 6，两者的交互作用对多糖得率影响显著，从图1 可以看出，随料液比和超声时间的增加，多糖得率不断上升，同时料液比曲面斜率大于超声时间曲面斜率，表明提取绣球菌多糖时，可以通过增加料液比、延长超声时间或多次提取以增加多糖得率。

由图2 可知，料液比与提取温度两个因素交互作用下的P=0.142，两者交互作用对多糖得率影响不显著。在单因素试验中发现，在料液比低、超声功率大的条件下，多糖提取液升温很快；温度过高，灭活了纤维素酶的活性，影响多糖得率，因而在响应面试验中设计了较低的温度区间并提高料液比值，排除了部分料液比和温度之间的交互影响。料液比曲面斜率大于提取温度曲面的斜率，表明提取绣球菌多糖时，料液比对多糖得率的影响大于提取温度对多糖得率的影响。料液比增加，多糖得率不断提高，在温度38 ℃附近多糖得率最高，为24.00%。

提取温度和超声时间两个因素交互作用下的P=0.000 25，两者的交互作用对多糖得率影响极显著（图3）。超声时间增加，有利于多糖得率提高，但随着超声时间增加，多糖提取液的温度升高，影响酶活，降低多糖得率，两者交互作用明显。

从等高线图、响应面图及方差分析结果可以直观看出，料液比、提取温度和超声时间3 个因素对绣球菌多糖得率均有极显著影响。通过模型预测，提取最佳参数为：料液比1∶87.62（g · mL-1），提取温度38.4 ℃，提取时间94.56 min，预测多糖得率为31.49%。对最佳预测模型参数进行验证试验，为便于操作，将试验参数调整为料液比1∶90（g · mL-1），提取温度38 ℃，超声时间95 min，进行多糖提取，平均多糖得率为30.60%，与模型评估值相比，相对误差为2.9%。加大绣球菌粉质量到50 g，按照最佳工艺进行多糖提取，平均多糖得率为31.70%，合并第1 次提取的滤渣，提取条件与第1 次相同，第2 次多糖得率为7.1%。与模型评估值相比，相对误差为0.6%。说明采用响应面法优化得到的绣球菌超声波辅助纤维素酶法提取多糖工艺条件参数准确可靠，利用本试验建立的模型在实践中进行预测是可行的。

2.5 纯化后多糖的保留率

经1.2.6 的方法纯化后，多糖保留率为73.20%。

3 结论与讨论

常用的多糖提取方法有水提法、醇提法、酶提法、超声提法，以及多种方法的复合提法。湖南省食用菌研究所保鲜加工课题组采用单因素试验方法，确定了影响多糖得率的3 个主要因素后，采用Box-behnken 设计优化了3 个因素的最佳值。优化后的最佳值为：酶添加量3%，超声功率570 W，料液比1∶90（g · mL-1），提取温度38 ℃，超声时间95 min。在此条件下，称取绣球菌粉5 g 进行试验验证，多糖得率为30.60%；称取50 g 绣球菌粉按照最佳优化条件进行2 次提取，第1 次多糖得率为31.70%，合并第1 次提取的滤渣，提取条件与第1 次相同，第2 次多糖得率为7.1%，说明一次提取绣球菌仍然有较多的多糖成分未析出，加大料液比及二次提取可以较大地提高多糖得率。将所得的粗多糖液合并浓缩，去除蛋白和色素并透析纯化后，多糖保留率达到73.20%，说明经此法提取多糖，粗多糖中的杂质亦不多，此法可以作为绣球菌活性多糖提取的有效方法。