基于BSA-SSR 技术初步筛选与叶用芥菜莱菔硫烷含量相关的分子标记

兰 梅 张丽琴 胡靖锋 徐学忠 杨红丽 和江明

（云南省农业科学院园艺作物研究所，国家蔬菜改良中心云南分中心，云南昆明 650205）

叶用芥菜（Brassica junceaCoss.var.foliosaBailey）原产于中国，简称叶芥菜，别名青菜、腊菜、春菜等，是十字花科芸薹属芥菜种中以叶片或叶球为产品器官的变种；喜冷凉湿润气候，适应性较强，品种繁多，长江流域以南地区栽培较为普遍（刘佩英，1996）。早在19 世纪80 年代，国际饮食营养及癌症委员会（International Diets Nutrition and Cancer Committees）就建议多食用十字花科蔬菜，因为十字花科蔬菜富含具有化学预防特性的硫苷类物质，可以预防癌症。Fahey 等（2001）研究发现，4-甲基亚磺酰丁基硫苷（RAA）普遍存在于十字花科芸薹属蔬菜中，如芥菜、白菜、青花菜等，其水解产物莱菔硫烷（sulforaphane，SF）是迄今为止在蔬菜中发现的抗癌活性最强的物质。流行病学和小鼠试验结果表明，莱菔硫烷能够显著降低肝癌（Keck et al.，2003）、乳腺癌（Pawlik et al.，2013）、胃癌（Fahey et al.，2002）、前列腺癌（Cho et al.，2005）、结肠癌（Rong et al.，2003）、皮肤癌（Xu et al.，2006）等的发生几率。当前对莱菔硫烷的报道多集中在青花菜上(何洪巨 等，2003；Liang et al.，2006；张婵娟 等，2007），且有研究表明莱菔硫烷/RAA 含量与基因型密切相关（Farnham et al.，2004；Abercrombie et al.，2005；邱海荣 等，2008；谢祝捷 等，2010）。

混合分组分析法（bulked segregant analysis，BSA）又称集群分离分析法，是一种快速检测与目标性状连锁标记的方法（Michelmore et al.，1991），现已广泛应用于动植物抗性基因、生长相关性状的筛选、鉴定等（白素兰 等，2000；严长杰 等，2000；Sun et al.，2009；Tripathi et al.，2009；史 明会，2013）。本试验采用高效液相色谱法（HPLC）测定了叶用芥菜F2单株的莱菔硫烷含量，构建F2混合分离群体（BSA）基因池，进行与莱菔硫烷含量基因连锁的SSR 分子标记研究，以期为叶用芥菜新品种的选育和种质资源创新奠定基础，亦为研究莱菔硫烷的分子调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试叶用芥菜材料由云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组提供（表1）。20 份材料均于2017 年11 月1 日播种，播种60 d 后每份材料分别随机选取3 株，取中心幼嫩叶片顶端部位，采用HPLC 法测定莱菔硫烷含量，得到1 份莱菔硫烷含量最高的叶用芥菜材料太乐四季青，含量为（226.72 ± 8.04）mg · kg-1；1份莱菔硫烷含量最低的材料圆叶春菜，含量为（11.79 ± 0.53）mg ·kg-1。以太乐四季青为母本，以圆叶春菜为父本进行杂交，2018 年4 月初收获F1种子；6 月25 日加代播种F1，进行套袋自交，11 月收获F2种子，得到叶用芥菜莱菔硫烷含量分离群体材料。

表1 参试20 份叶用芥菜材料的品种名称及来源

1.2 试验方法

1.2.1 叶用芥菜F2莱菔硫烷含量的测定 2018 年12 月1 日播种100 份F2材料，播种60 d 后随机选取80 个F2单株，分别取中心幼嫩叶片顶端部位，采用HPLC 法测定莱菔硫烷含量。

准确称取0.20 g 样品放入研钵中磨碎，加入pH 值为7.0 的磷酸盐缓冲液（0.1 mol · L-1磷酸氢二钾和0.1 mol · L-1磷酸二氢钾）6.0 mL，37 ℃下酶解2.0 h，然后加入6 mL 乙酸乙酯（AR）继续混匀30 min，4 000 r · min-1离心10 min，收集上清液；再重复提取2 次，将3 次收集的上清液在旋转蒸发仪上蒸干，旋蒸温度为35 ℃；最后用6 mL 乙腈定容，过0.22 μm 滤膜后-20 ℃低温保存待测。

采用Rigol L3000 高效液相色谱仪，紫外波长201 nm；色谱柱：Kromasil C18 反相色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；时间：30 min；流速：0.8 mL · min-1；进样体积：10 μL；流动相的配制：将超纯水1 000 mL、甲醇1 000 mL用0.45 μm 的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱，甲醇∶水=35V∶65V。

1.2.2 叶用芥菜亲本、F2各单株DNA 的提取 以亲本太乐四季青、圆叶春菜及80 份F2单株幼嫩叶片为材料，采用2×CTAB 法（称取EDTA 7.44 g、Tris 12.1 g 和NaCl 81.8 g，溶于800 mL 超纯水中，用HCL 调pH 至8.0；再加入20 g CTAB，加热至60 ℃使之溶解，用超纯水定容至1 000 mL，37 ℃条件下保存）分别提取DNA（Fu et al.，2006）。然后用1×TE 溶解稀释DNA 至50 ng · μL-1，检测DNA 的质量。置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 混合池的构建 根据Michelmore 等（1991）提出的BSA 法，从F2群体中选取高莱菔硫烷含量和低莱菔硫烷含量单株各10 株，分别取10 μL DNA 混合均匀，构成高莱菔硫烷含量池（H）和低莱菔硫烷含量池（L），并分别检测DNA 质量。

1.2.4 PCR 扩增及产物检测 根据芸薹作物网（http：//www.brassica.info/tools/genetic_markers.html）公布的十字花科芸薹属共同引物和史明会（2013）关于青花菜中与RAA 含量相关的SSR 分子标记研究结果，合成50 对引物用于PCR 扩增。采用昆明硕擎生物科技有限公司提供的Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×），其中含有DNA polymerase、Buffer、dNTPs 等组分，添加上、下游引物和DNA 模板，利用梯度PCR 仪筛选引物退火温度，最终得到适合叶用芥菜SSR 分析的体系（25 μL）：PCR Mix 22 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL。PCR 扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，72 ℃再延伸1 min，35 个循环；最后于4 ℃保存。

取PCR 反应液5 μL，直接上样，采用1%琼脂凝胶电泳检测，在Bio-rad 凝胶成像系统上进行观察并拍照。

1.2.5 相关性验证 将初步筛选得到的引物在与其相对应建立的F2高莱菔硫烷含量和低莱菔硫烷含量混合基因池中扩增，进一步确定筛选得到的引物具有稳定遗传的多态性。然后，再用筛选出来的引物在亲本和F2分离群体中进行扩增，验证其是否与莱菔硫烷目标性状连锁，初步得到与莱菔硫烷含量相关的SSR 标记及其引物。

2 结果与分析

2.1 叶用芥菜F2 单株的莱菔硫烷含量

从表2 可以看出，80 个叶用芥菜F2单株中，莱菔硫烷含量相对较高的10 个单株编号分别为50、38、5、57、4、68、32、59、40、55，莱菔硫烷含量相对较低的10 个单株编号分别为74、7、16、73、69、15、71、43、24、22。

表2 叶用芥菜F2 单株莱菔硫烷含量的测定结果

2.2 DNA 的检测结果

2.2.1 亲本及F2单株DNA 的检测结果 供试叶用芥菜亲本太乐四季青、圆叶春菜及80 个F2单株提取的DNA 均表现为条带清晰、整齐，无拖尾现象，说明提取的DNA 质量较好。利用核酸检测仪检测显示，亲本以及80 个F2单株DNA 样品浓度在800～2 000 ng · μL-1之间，A260/280在1.8～2.0之间，所提取的DNA 质量能够满足后续试验的进行。

2.2.2 混合池DNA 的检测结果 分别取10 个莱菔硫烷含量较高的F2单株的DNA 各10 μL，等量混合，构成H 池；再分别取10 个莱菔硫烷含量较低的F2单株的DNA 各10 μL，等量混合，构成L 池。利用核酸检测仪检测显示，H 池DNA 浓度为92.5 ng · μL-1，A260/280为1.852；L 池DNA 浓度为86.7 ng · μL-1，A260/280为1.829。可以满足后续的PCR 扩增。

2.3 引物的筛选

用50 对引物组合对叶用芥菜亲本太乐四季青和圆叶春菜进行初步筛选，结果表明有16 对引物在双亲间表现出多态性；然后根据BSA 法构建的高、低莱菔硫烷含量池进一步筛选，得到9 对多态性引物（图1）。

2.4 多态性引物的验证结果

将9 对多态性引物在高、低莱菔硫烷含量池的单株中进行验证，最终得到2 个SSR 多态性标记SF12 和SF28，引物信息见表3 和图2。

表3 2 个SSR 多态性标记的引物序列

SF12 和SF28 都是显性标记，SF12 在父本圆叶春菜、低莱菔硫烷含量池L 和低莱菔硫烷含量池单株中均扩增出大小约为250 bp 的条带，而在母本太乐四季青、高莱菔硫烷含量池H 和高莱菔硫烷含量池单株中相应位置未扩增出条带（图2-A、B）；SF28 在母本太乐四季青、高莱菔硫烷含量池H 和高莱菔硫烷含量池单株中均扩增出大小约为250 bp 的条带，而在父本圆叶春菜、低莱菔硫烷含量池L 和低莱菔硫烷含量池单株中相应位置未扩增出条带（图2-C、D）。

M，BM 2000+DNA Marker；P1，太乐四季青；P2，圆叶春菜；H，高莱菔硫烷含量池；L，低莱菔硫烷含量池；H1～H10，高莱菔硫烷含量池单株；L1～L10，低莱菔硫烷含量池单株。

2.5 SF12 和SF28 在F2 群体中的扩增结果

由图3 可知，SF12 在低含量莱菔硫烷亲本圆叶春菜和F2部分莱菔硫烷含量相对较低的单株中扩增出条带（图3-A），而SF28 在高含量莱菔硫烷亲本太乐四季青和F2部分莱菔硫烷含量相对较高的单株中扩增出条带（图3-B），进一步验证了这2 对引物与叶用芥菜中莱菔硫烷含量性状的相关性。

3 结论与讨论

目前，国内外对莱菔硫烷的医学价值报道较多，对叶用芥菜中莱菔硫烷含量的研究鲜有报道。本试验以2 个莱菔硫烷含量差异较大的叶用芥菜高代自交系为亲本杂交得到的F2分离群体为研究背景，利用BSA 法并结合SSR 分子标记技术进行莱菔硫烷含量相关的分子标记筛选，初步确定了2 个与叶用芥菜中莱菔硫烷含量连锁的标记。

当前对十字花科蔬菜莱菔硫烷的报道多集中在青花菜上，李占省等（2012）结合青花菜DH 群体花球中莱菔硫烷含量，最终获得了与莱菔硫烷含量相关的13 个QTL，这些QTL 位点分布于4 条连锁群上。史明会（2013）研究了青花菜中与RAA 相关的SSR 分子标记，得到4 个与莱菔硫烷的前体物质RAA 相关基因紧密连锁的多态性标记。本试验测定了叶用芥菜叶片中莱菔硫烷的含量，结果显示不同品种间含量差异较大，但本试验没有验证不同时期叶用芥菜叶片中莱菔硫烷含量是否差异较大；本试验虽然初步获得了2 个与叶用芥菜中莱菔硫烷含量连锁的标记，但由于F2群体较小，试验结果的精确性可能会受到影响，有待进一步研究验证。