盘龙七片调控SIRT1/NF-κB通路对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

刘 婷，熊轶喆，杜国庆，王 翔

(上海中医药大学附属曙光医院骨伤科，上海 200021)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是以局部关节疼痛、肿胀、晨僵、畸形为主要临床表现的慢性关节软骨退行性病变，可导致患者活动能力受限，是中老年人的常见病、多发病。研究表明，盘龙七片治疗寒湿痹阻型膝骨关节炎疾病临床效果显著，能够缓解患者疼痛肿胀的症状，安全性较高，具有很高的临床应用价值。然而盘龙七片治疗OA的具体作用机制尚不清楚。研究表明，软骨细胞过度凋亡是骨性关节炎的主要病理特征，在动物和人的体内、体外研究中软骨细胞凋亡与OA严重程度之间有相关性。沉默信息转录调控因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)广泛存在于机体多种细胞之中，参与多种疾病的病理过程，在OA的抗炎中起着重要作用。刘军等研究表明，薯蓣皂苷元通过激活SIRT1通路，进一步减轻软骨细胞炎症反应、线粒体氧化应激损伤和细胞凋亡，从而发挥预防与治疗OA的作用。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路在各种细胞进程中起着重要作用，不仅可以调节炎症作用，还可以调节软骨细胞凋亡。鲁宏等研究表明，香叶木素通过抑制NF-κB通路活化缓解白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)诱导的新生大鼠OA软骨细胞凋亡和免疫反应。为进一步研究其作用机制，本研究从细胞凋亡和SIRT1/NF-κB信号通路的角度探究盘龙七片治疗OA的作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级C57B/L6雄性小鼠60只(4～6周龄)，购自广州中医药大学实验动物中心[生产许可证号：SCXK(粤)2019-0047]。

1.2 药物和试剂 盘龙七片(批号 20190401，每片0.3 g)：陕西盘龙药业集团股份有限公司；硫酸氨基葡萄糖胶囊(批号 2392016，每粒0.25 g)：浙江海正药业股份有限公司；生理盐水(国药准字 H13023201)：石家庄第四制药厂；DMEM-F12培养基(11320-033)、胰蛋白酶(25200-056)：Thermo Fisher Scientific；胎牛血清(F8245-100)：杭州四季青有限公司；辣根过氧化物酶标记二抗山羊抗鼠IgG(ZB-2305)：中杉金桥公司。蛋白提取裂解液(P0013)、BCA试剂盒(P0010)、Annexin Ⅴ-FITC试剂盒(C1063)：江苏碧云天生物技术有限公司；β-actin单克隆抗体(9470)、NF-κB单克隆抗体(8242)：Cell Signaling Technology；SIRT1单克隆抗体(ab110304)：Abcam公司。Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin基因序列设计引物：由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 动物分组及模型复制 参考文献[7]的方法，手术切除小鼠右膝关节内侧半月板和前交叉韧带，以复制OA模型。模型复制成功标准：小鼠出现步态异常和行走缓慢，且小鼠左侧膝关节直径较右侧增加值≥0.5 mm。模型复制成功后，将小鼠随机分成模型组，盘龙七片低、中、高剂量组，阳性对照组，每组10只，并设置正常对照组。盘龙七片低、中、高剂量组小鼠分别按137、273、546 mg/(kg·d)给药，阳性对照组小鼠按228 mg/(kg·d)给予硫酸氨基葡萄糖，去掉胶囊后溶于生理盐水中灌胃。将盘龙七片研磨成粉末，用生理盐水溶解后灌胃给药，每日给药1次，连续4周。正常对照组、模型组小鼠给予等容积生理盐水灌胃，连续4周。4周后采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，无菌条件下剪取小鼠膝关节组织(股骨髁及胫骨平台软骨)，剥离软骨组织，待用。

2.2 软骨组织染色 将分离的软骨组织用4%多聚甲醛溶液固定，然后使用番红O-快速绿染色。参考改良的Mankin等评分方法，从整体结构、细胞结构、番红染色、潮线完整性4个方面对小鼠的OA进行评分，最低0分，最高14分，评分越高，表明关节炎越严重。

2.3 流式细胞仪检测软骨细胞凋亡 无菌条件下分离小鼠软骨组织，剪碎并加入胰蛋白酶消化后，离心，收集软骨细胞，并进行后续实验。使用DMEM培养液制备1×10/mL的单细胞悬液，使用预冷的PBS洗涤后，加入Annexin Ⅴ-FITC试剂盒试剂，置于流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.4 qRT-PCR检测软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平 收集各组软骨细胞，使用RNA提取试剂盒提取各组软骨细胞总RNA，再使用反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA，将cDNA于-20 ℃冰箱保存。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。反应条件：95 ℃，120 s；95 ℃，30 s；60 ℃，75 s；95 ℃，30 s；40个循环。每个样品设置3个复孔。反应结束后，采用2-ΔΔC法计算Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3及内参β-actin基因引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.5 Western blot法检测软骨细胞SIRT1、NF-κB蛋白表达水平 收集各组软骨细胞，加入含蛋白酶抑制剂裂解液，严格按照试剂盒说明书提取各组总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，100 ℃水浴变性10 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后转至PVDF膜上，用5% BSA室温封闭2 h，分别加入1∶2 000稀释的SIRT1、NF-κB抗体，4 ℃过夜孵育，再加入相应的二抗，室温孵育2 h，滴加ECL显色液，利用凝胶成像仪对Western blot印迹条带进行定量分析。

3 结果

3.1 各组小鼠膝关节软骨的组织形态学变化 番红O-快速绿染色结果显示：正常对照组小鼠细胞核呈蓝色，关节间隙正常，细胞排列层次分明，关节软骨组织被染成红色，软骨下骨为绿色；模型组小鼠膝关节面不平整，细胞结构层次混乱，关节间隙十分狭窄；盘龙七片低、中、高剂量组小鼠关节间隙稍狭窄，但仍清晰可见，但有部分破坏，随着浓度升高，关节间隙明显，关节轮廓可见。见图1。

注:A.正常对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.盘龙七片低剂量组;E.盘龙七片中剂量组;F.盘龙七片高剂量组图1 各组小鼠膝关节软骨的组织形态学变化(番红O-快速绿染色,10×20倍)

3.2 各组小鼠的OA评分比较 与模型组比较，阳性对照组和盘龙七片低、中、高剂量组小鼠的OA评分均显著降低(

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05)，盘龙七片降低OA评分的效应呈剂量依赖性。见表2。

表2 各组小鼠的OA评分比较

3.3 各组小鼠膝关节软骨细胞凋亡率比较 与正常对照组比较，模型组小鼠膝关节软骨细胞凋亡率显著增加(

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05)；与模型组比较，阳性对照组和盘龙七片低、中、高剂量组小鼠膝关节软骨细胞凋亡率显著降低(

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05)；盘龙七片降低软骨细胞凋亡率的效应呈现剂量依赖性(

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05)。见图2和表3。

注:A.正常对照组;B.模型组;C.阳性对照组;D.盘龙七片低剂量组;E.盘龙七片中剂量组;F.盘龙七片高剂量组图2 流式细胞仪检测各组小鼠膝关节软骨细胞凋亡率

表3 各组小鼠膝关节软骨细胞凋亡率比较

3.4 各组小鼠膝关节软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠膝关节软骨细胞Bax、Caspase-3 mRNA表达水平显著增加，Bcl-2表达水平降低，差异均有统计学意义(

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05)；与模型组比较，阳性对照组和盘龙七片低、中、高剂量组软骨细胞Bax、Caspase-3 mRNA表达水平显著降低，Bcl-2 mRNA表达水平显著升高，差异均有统计学意义(

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05)，盘龙七片的效应呈剂量依赖性。见表4。

表4 各组小鼠膝关节软骨细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相对表达水平比较

3.5 各组小鼠膝关节软骨细胞中SIRT1、NF-κB蛋白相对表达水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠软骨细胞SIRT1表达水平显著降低，NF-κB表达水平显著增加，差异均有统计学意义(

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05)；与模型组比较，阳性对照组与盘龙七片低、中、高剂量组软骨细胞SIRT1表达水平显著增加(

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05)，NF-κB表达水平显著降低(

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05)，盘龙七片的效应呈剂量依赖性。见图3和表5。

注：A.正常对照组；B.模型组；C.阳性对照组；D.盘龙七片低剂量组；E.盘龙七片中剂量组；F.盘龙七片高剂量组

表5 各组小鼠膝关节软骨细胞中SIRT1、NF-κB蛋白相对表达水平比较

4 讨论

OA是一种常见的慢性关节疾病，主要表现为膝关节(单侧或双侧)疼痛、酸胀、关节僵硬，重者站立及行走等活动功能障碍，有着高发病率、高致残率、治疗周期长的特点。在本研究中，番红O-快速绿染色显示正常对照组细胞核呈蓝色，关节间隙正常，细胞排列层次分明，关节软骨组织被染成红色，软骨下骨为绿色，而模型组关节面不平整，细胞结构层次混乱，关节间隙十分狭窄，与谭清梅等研究结果类似，提示小鼠OA模型复制成功。

OA属中医学“痹证”“骨痹”范畴。中医学治疗寒湿痹阻型OA的方法较多，但治法几乎以祛风散寒除湿为主。盘龙七片主要包含盘龙七、川乌、草乌、当归、杜仲、丹参等29味药材，盘龙七具有补脾健胃、收涩固肠、除湿利水、活血之功，丹参具有扩张血管，加强心肌收缩的功能，方中川乌、草乌、秦艽、伸筋草祛风散寒除湿止痛。诸药共奏活血化瘀、祛风除湿、消肿止痛之功，常与其他药物联合治疗OA。研究表明，盘龙七对寒湿痹阻型OA有效。小鼠寒湿痹阻型OA模型尚无文献依据，因此，本研究复制小鼠OA模型时未考虑中医证型。本研究发现，使用盘龙七片治疗后，OA小鼠膝关节破坏减轻，关节间隙明显，提示盘龙七片对OA具有一定的保护作用。

有研究表明，软骨细胞凋亡以及软骨下骨异常骨重建与OA发病密切相关。何健宜等研究表明，高脂饮食诱导的OA小鼠膝关节软骨凋亡细胞数增多。因此，寻找有效抑制软骨细胞过度凋亡且能促进软骨细胞增殖的药物具有重要意义。本研究结果发现，与正常对照组相比，模型组软骨细胞凋亡率增加，与模型组比较，盘龙七片低、中、高剂量组软骨细胞凋亡率显著降低，并呈剂量依赖性，提示盘龙七片有抑制小鼠软骨细胞凋亡的作用。Bax mRNA是促凋亡基因，Bcl-2 mRNA为抗凋亡基因，Caspase-3是细胞凋亡的重要标志，在细胞凋亡过程中发挥重要作用。本研究发现，盘龙七片呈剂量依赖性地降低小鼠膝关节软骨细胞Bax、Caspase-3 mRNA表达水平，升高Bcl-2 mRNA表达水平，提示盘龙七片抑制小鼠软骨细胞凋亡的机制与调节凋亡相关基因的表达水平有关。

SIRT1广泛存在于机体多种细胞之中，被认为与细胞的基因转录、增殖凋亡等密切相关，在软骨细胞外基质合成及抗炎作用中起着重要作用。李春亮等研究表明，SIRT1在OA软骨组织中低水平表达，通过上调SIRT1表达水平，可显著抑制软骨细胞凋亡及调控凋亡相关蛋白的表达水平。多种信号转导通路参与OA的病理进程，其中NF-κB通路通过促炎反应发挥作用已被证实。研究表明，激活SIRT1可抑制NF-κB信号途径的氧化应激反应。Zhang等研究表明，小檗碱能够通过调节SIRT1/NF-κB信号通路，抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的炎症反应。Han等研究表明，SIRT1通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，而阻止人卵巢颗粒细胞的凋亡。本研究结果发现，盘龙七片呈剂量依赖性地升高OA小鼠膝关节软骨细胞SIRT1表达水平，降低NF-κB表达水平。结果提示盘龙七片可能通过上调SIRT1的表达水平，抑制NF-κB信号通路，进一步抑制软骨细胞凋亡。

综上所述，盘龙七片可抑制OA软骨细胞凋亡，其作用机制可能与SIRT1/NF-κB信号通路有关。但本研究局限于SIRT1/NF-κB信号通路相关因子表达水平的变化情况，未对通路进行验证，仍需做进一步研究。