乳糜微粒流对黄芩苷纳米乳动物体内组织分布的影响研究

仇静文，郑转弟，钟 华，吴鸿飞

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)

黄芩是记载于《神农本草经》的传统药材之一，在中国应用历史悠久。黄芩苷作为黄芩的主要药用成分，药理作用广泛，在临床治疗急、慢性肝炎中发挥着重要作用。乙型肝炎病毒容易通过淋巴转运在淋巴系统中蓄积，形成肝外的病毒储存库，由于淋巴系统结构特殊，黄芩苷常规剂型只可清除血液中的病毒，使肝炎患者血液指标达到正常，无法根本清除藏匿于体内淋巴系统中的病毒，从而导致大多数患者难以痊愈。

纳米乳是由油、水两种不混溶的液体，在适当辅料稳定下自发形成的分散系统，热力学、动力学稳定，在长期储存过程中没有任何明显的絮凝或聚结。纳米乳具有比表面积大、粒径小和亲脂性组分比例大的特点。纳米乳制剂被吸收消化形成乳滴后，会与分泌肠上皮细胞脂蛋白特别是乳糜微粒结合，组装形成囊泡，最终进入淋巴循环系统。因此，纳米乳作为新型淋巴靶向给药载体受到愈来愈多的关注。

笔者所在课题组一直致力于构建难溶性药物油基纳米制剂，前期实验发现此纳米乳体系可增加药物经淋巴系统转运，从而提高药物吸收，但纳米乳是否通过乳糜微粒的介导尚不清楚。本实验以油包水(W/O)型黄芩苷纳米乳为研究对象，建立乳糜微粒流阻断模型，考察乳糜微粒介导的跨膜转运是否会对黄芩苷纳米乳在大鼠体内的淋巴靶向性产生影响，初步阐明黄芩苷纳米乳具有淋巴靶向性的机制，以期为黄芩苷纳米乳的临床应用、淋巴靶向制剂的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦液相色谱仪(1260 Infinity型)：美国Agilent科技有限公司；台式高速冷冻离心机(Allegra 64R型)：美国Beckmancoulter有限公司；高速分散均质机(FJ-200型)：上海标本模型厂；电子分析天平(FA 2104B 型)：德国Sartorius集团。

1.2 药品与试剂 黄芩苷对照品(批号 110715-301218，含量≥98%)：中国食品药品检定研究所；黄芩苷原料药(批号 141201，含量≥85%)：四川省玉鑫药业有限公司；大豆磷脂：沃森生物；芦丁内标：国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心；肉豆蔻酸异丙酯：国药集团化学试剂有限公司；环己酰亚胺(cycloheximide，CHM)：奥默生物技术有限公司；所用试剂均为色谱纯。

1.3 动物 SD大鼠120只，体质量为230～270 g，常州卡文斯实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-001。所有实验动物均适应性饲养1周。本实验有关实验动物护理与实验过程，遵循安徽中医药大学有关实验动物保护与使用规范。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Topsil C(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流动相：甲醇-水(含0.1%磷酸，比例：47∶53)，等度洗脱；紫外检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 生物样品处理 称取适量大鼠组织样品，加入3倍量甲醇制得组织匀浆液。取200 μL组织匀浆液，加入等量磷酸二氢钾，芦丁内标(7.05 μg/mL)混匀，再加入200 μL甲醇和400 μL乙腈去除蛋白，涡旋混匀，于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，移取上清液，水浴氮气吹干，残留物用100 μL流动相复溶，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取20 μL上清进样分析。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性 取大鼠空白组织样品、黄芩苷对照品加空白组织样品和给药后组织样品，在“2.1项”色谱条件下分析，考察方法专属性。以大鼠肝组织为例，芦丁内标和黄芩苷分别于7.59、14.41 min处出现吸收峰(见图1)，芦丁内标与黄芩苷分离度高，峰形好，同法考察其他组织的专属性，各组织中黄芩苷浓度的测定未受到内源性物质的干扰。

注：A1.肝组织；A2.空白加药肝组织；A3.空白肝组织

2.3.2 标准曲线制备 称量5.0 mg黄芩苷对照品，加甲醇精密制备浓度为50.0 μg/mL的对照品储备液，吸取储备液用甲醇进一步稀释，配制成浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的系列对照品溶液备用。分别精密吸取200 μL大鼠的空白组织匀浆液，依次加入200 μL芦丁内标和100 μL的系列黄芩苷对照品溶液，制备成浓度依次为5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/mL的黄芩苷对照品加组织样品，按照“2.1”项下色谱条件分析，以黄芩苷与内标峰面积的比值为横坐标(

X

)，相应浓度为纵坐标(

Y

)进行加权回归，制备标准曲线。结果显示，大鼠淋巴组织器官中黄芩苷在0.05～5.0 μg/L浓度范围内回归系数(

r

)均大于0.999 7，呈现良好的线性关系。见表1。

表1 大鼠淋巴组织器官标准曲线

2.3.3 精密度 取低、中、高(0.05、0.5、5 μg/mL)3个浓度的加药空白组织样品溶液，按“2.1”项下测定，1 d内测5次，连续测3 d，计算批间与批内精密度。结果表明，在该色谱条件下，测得大鼠各淋巴组织器官的批内、批间精密度RSD均小于7.0%，表明仪器精密度高，符合要求。

2.3.4 提取回收率 取低、中、高(0.05、0.5、5 μg/mL)3个浓度的加药空白组织样品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积(

A

)，同时记录该色谱条件下相同浓度的黄芩苷对照品加芦丁内标溶液的峰面积(

A

)，提取回收率=

A

/A

×100%。结果表明，在该色谱条件下，测得大鼠各组织中黄芩苷提取回收率在93.85%～97.38%，RSD低于6%，表明该方法提取回收率高。

2.3.5 稳定性 取低、中、高(0.05、0.5、5 μg/mL)3个浓度的加药空白组织样品溶液，室温放置24 h，-20 ℃冻存14 d，经3个冻融循环，按照“2.1”项下色谱条件操作，考察该方法的稳定性。结果表明，在上述条件下，大鼠的RSD均小于6%，表明组织样品在上述处理中稳定性良好。

2.4 乳糜微粒流对大鼠组织药物分布的影响

2.4.1 黄芩苷纳米乳和混悬剂的制备 参照本课题组前期的研究，称取313.5 mg黄芩苷原料药，加入10.5 g丙二醇、10.5 g大豆磷脂和9.0 g丙酯的混合溶液中，恒温水浴搅拌至完全溶解，再逐滴加入3.0 g双蒸水磁力搅拌，最终制得淡黄色透明液体[载药量：9.5 mg/mL；平均粒径：(63.40±1.1) nm]。称取181.0 mg黄芩苷原料药加入20 mL双蒸水中，混匀即得黄芩苷混悬剂。

2.4.2 实验动物分组及给药 实验采用大鼠腹腔注射环己酰亚胺复制经典的大鼠乳糜微粒阻断模型。将雄性大鼠随机分为4组，分别为黄芩苷混悬剂阻断组、黄芩苷混悬剂未阻断组、黄芩苷纳米乳阻断组和黄芩苷纳米乳未阻断组。给药前禁食12 h。黄芩苷混悬剂阻断和黄芩苷纳米乳阻断组大鼠灌胃给予环己酰亚胺(3 mg/kg)；黄芩苷混悬剂未阻断和黄芩苷纳米乳未阻断组大鼠灌胃给予等量0.9%氯化钠溶液，并于1 h后，分别灌胃给药黄芩苷混悬剂和黄芩苷纳米乳(144.0 mg/ kg，按照动物体表面积换算)。

2.4.3 生物样品的采集 各组大鼠(

n

=3)于灌胃0.5、1、2、4、6、8、10、12、18、24 h后断头处死，收集各组织，0.9%氯化钠水溶液将各组织洗净，吸干，精密称质量，按“2.1”项下色谱条件和“2.2”项下方法测定各组织中黄芩苷浓度。

2.4.4 数据处理及统计学分析 采用DAS 2.0程序处理大鼠各淋巴组织器官的黄芩苷浓度-时间数据，获得药物代谢动力学参数；采用SPSS 23.0软件进行统计分析。

(1)阻断组及未阻断各组大鼠组织的血药浓度-时间曲线 黄芩苷混悬剂阻断组和未阻断组大鼠的体内组织分布情况相似，而黄芩苷纳米乳阻断组和未阻断组大鼠的体内组织分布特性存在显著性差异；与黄芩苷纳米乳未阻断组相比，纳米乳阻断组大鼠的血药浓度-时间曲线下面积和药峰浓度在脾、胸腺、淋巴中增大，肝中减小，该结果表明乳糜微粒介导的跨膜转运可能会对黄芩苷纳米乳在淋巴组织中的分布产生影响，含黄芩苷的纳米乳制剂可能是通过乳糜微粒介导的跨膜转运被机体吸收。见图2。

注：A.肝；B.脾；C.胸腺；D.淋巴

(2)黄芩苷浓度-时间数据分析及主要药物代谢动力学参数 由表2、表3、图3可知，与纳米乳药物代谢动力学阻断组相比，纳米乳药物代谢动力学未阻断组大鼠淋巴、胸腺和脾

c

提高了1.2倍以上，差异均有统计学意义(

P

<0

.

05)；大鼠脾、胸腺和淋巴结AUC显著增加(

P

<0

.

05)；大鼠肝、胸腺和淋巴结MRT明显增加(

P

<0

.

05)；与纳米乳组结果相反，混悬剂阻断组和未阻断组在淋巴组织器官和肝组织中的药物动力学参数比较，差异均无统计学意义(

P

>0

.

05)；表明乳糜微粒介导的跨膜转运可以提高黄芩苷纳米乳在胸腺、淋巴结中的分布，使药物在淋巴组织的停留时间增加，对黄芩苷混悬剂在组织中的分布没有影响。

表2 黄芩苷纳米乳药物代谢动力学阻断组、未阻断组在各组织中的药物代谢动力学参数

表3 黄芩苷混悬剂乳糜微粒阻断组、未阻断组在各组织中药物代谢动力学参数

注:与黄芩苷纳米乳阻断组比较,*P<0.05图3 乳糜微粒途径对黄芩苷纳米乳组织(A)、黄芩苷混悬剂组织(B)分布的影响

3 讨论

黄芩苷体内吸收代谢局限、口服生物利用低，前期研究证实，黄芩苷纳米乳口服生物利用度是混悬制剂的14.56倍，淋巴转运量可达26.8%，但纳米乳是否通过乳糜微粒的介导尚不清楚。

本研究建立淋巴阻断动物模型，考察乳糜微粒流对纳米给药系统体内分布的影响。淋巴阻断动物模型主要包括动物淋巴插管模型和乳糜微粒阻断模型，动物淋巴管插管模型是通过插管收集动物淋巴液，测定药物含量，计算药物经淋巴转运量，但此方法由于乳糜池与胸导管位置较深，并且周围存在大量的血管，所需手术技术复杂，成功率较低，而乳糜微粒阻断模型由于操作步骤简便、成功率高，已被医药工作者应用于药物经淋巴转运，且研究证实该模型与淋巴管插管动物模型具有很高的相关性。

乳糜微粒阻断模型的构建是通过给大鼠灌胃给予一定量的环己酰亚胺，抑制大鼠体内乳糜微粒的分泌，从而最终阻断药物进入淋巴系统。大鼠注射环己酰亚胺后，显著影响黄芩苷纳米乳在大鼠淋巴组织器官的AUC、

c

等药物代谢动力学参数，表明乳糜微粒介导的跨膜转运有利于黄芩苷纳米乳在淋巴组织器官中的吸收和分布。此纳米给药系统以脂质大豆油为基质，药物经淋巴转运的淋巴生化过程需要一定量的脂质，脂质在一定程度上辅助了药物经淋巴转运。乳糜微粒在纳米乳的刺激下分泌增多，从而增加黄芩苷经淋巴系统转运总量，从而使药物在体内淋巴组织器官内富集，这可能是黄芩苷纳米乳具有淋巴靶向性的原因，但具体机制有待更深入的探索。