电针时间对急性心肌缺血大鼠保护作用及心肌核转录因子-κB表达水平的影响

瞿巧钰，童 艳，朱 超,王言玲，王 堃，吴生兵,周美启

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230038；3.安徽省中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800)

冠状动脉粥样硬化型心脏病，是指冠状动脉发生粥样型硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血低氧或坏死而引起的心脏病，简称“冠心病”，也称“缺血性心脏病”。因冠状动脉粥样硬化导致的急性心肌梗死，其高发病率和高死亡率已成为全球面临的公共卫生问题之一。中医学关于针刺治疗“胸痹”在《黄帝内经》中早有记载；现代临床研究也表明，针刺能改善患者心电图的心率、ST段改变、心绞痛程度，从而达到治疗心肌缺血的目的。

核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)是一类关键的核转录因子，能调节多种炎症递质的表达，并且参与了细胞的生长、存活、分化、调亡，介导多种炎症及免疫相关性疾病的病理过程。急性炎症反应是缺血的一种表现，降低炎症细胞因子水平以及减少白细胞浸润能够改善缺血症状。有研究发现，大鼠心肌缺血后心肌组织的NF-κB mRNA表达水平增加，表明NF-κB与心血管疾病密切相关。电针能够减少细胞凋亡，减轻心肌缺血过程中的炎症反应，起到保护心肌组织的作用。目前，关于电针时间对心肌NF-κB蛋白及mRNA表达影响的研究较少，本研究拟通过观察缺血心肌组织中NF-κB蛋白及mRNA表达水平，探讨电针介入时间对急性心肌缺血大鼠损伤保护作用的可能机制，为临床治疗此类疾病的时间量化提供参考。

1 材料

1.1 实验动物与分组 选取健康清洁级雄性大鼠50只，体质量(220±10)g，由安徽医科大学饲养中心[生产许可证号：SCXK(皖)2017-001]提供，在康为IR60独立送风隔离笼具内饲养，笼内温度控制在(22±1)℃，相对湿度60%。自然光线，室温环境下适应性喂养1周后，采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、电针即刻组、电针1 d组、电针3 d组、电针5 d组、电针7 d组，每组6只。实验中死亡8只，实验过程中动物的处置符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.2 主要试剂与仪器 异氟烷：瑞沃德公司；异丙醇：上海苏懿化学试剂有限公司；PBS缓冲液粉末、GAPDH：Proteintech；羊抗兔HRP标记二抗：上海碧云天；NF-κB：Abcam；Trizol：Invitrogen；DEPC处理水：基尔顿生物；SYBR Green PCR试剂盒：Thermo；逆转录试剂盒：Fermentas；肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin，IMA)：江莱生物。

Powerlab 16导生理记录仪：澳大利亚AD instruments公司；电泳仪(mini protean 3 cell)：BIO-RAD公司；电转仪(PS-9)：大连竞迈科技有限公司；水浴锅(型号 HI1210)：莱卡公司；成像系统(Tanon-5200)：Tanon。Real-time PCR检测仪：ABI公司；低温冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；旋涡振荡器：青浦泸西仪器厂；电动匀浆机：FLUKO；酶标仪(型号 MK3)：芬兰雷勃；华佗牌针灸针具；带线缝合针(6-0)：上海金环医疗公司；SDZ-V电针仪：苏州针灸用品厂。

2 方法

2.1 模型复制方法 模型组、电针组采用结扎心脏冠状动脉左前降支法制备急性心肌缺血模型，将大鼠放置麻醉诱导箱中，使用5%异氟烷诱导麻醉1 min后放于实验台上仰卧位固定四肢，面罩吸入1%异氟烷维持麻醉状态。无菌操作备皮后钝性分离左胸皮下筋膜、肌肉，止血钳钝性穿破第4、5肋间后挤出心脏，于左心耳下缘2～3 mm冠状动脉左前降支处以6-0带线缝合针进针结扎，心脏复位，挤出胸腔残余空气后缝合且予青霉素钠喷洒伤口防止感染，复制模型后使用电生理记录仪记录肢体Ⅱ导联心电图，以ST段弓背抬高作为评判急性心肌缺血模型是否复制成功的标准。

2.2 干预方法 参照《实验针灸学》结合以往的研究成果进行腧穴定位，选取手少阴心经“神门-通里”段。在大鼠左右腕部各刺入3根0.30 mm×25 mm的一次性无菌针灸针，间距为2 mm，连接电子针疗仪，疏密波，电流强度为1 mA，频率为2 Hz，每次30 min，即刻电针组在模型复制完成后立即予以电针1次，电针1 d组在模型复制后第2天时干预1次，电针3 d组连续干预3 d，电针5 d组连续干预5 d，电针7 d组连续干预7 d，每日1次。而正常组和模型组不予电针处理。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 心电图检测 使用PowerLab Systems记录肢体Ⅱ导联心电图，将电极刺于大鼠左后、右前与右后肢皮下，记录心电图，根据ST段抬高情况，判断是否成功复制急性心肌缺血模型。

2.3.2 ELISA法检测血清CK、CK-MB、IMA水平 将大鼠麻醉后腹主动脉取血于采血管内，放入冷冻离心机中3 500 r/min离心10 min。离心后取上清液放入冻存管中，放于-80 ℃冰箱保存待测。具体方法按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测血清血清CK、CK-MB、IMA水平。

2.3.3 Western blot 法检测大鼠心肌组织NF-κB蛋白表达水平 将心肌组织取出，4 ℃下采用裂解液[

V

(RIPA)∶

V

(PMSF)=100∶1]充分裂解细胞，蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱，用于检测NF-κB蛋白表达水平。电泳分离蛋白样品，浓缩胶75 V，20 min，分离胶115 V，75 min。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。5%脱脂奶粉室温封闭NC膜2 h，一抗膜室温孵育，4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h，洗膜3次。ECL试剂盒化学发光显影，用Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

2.3.4 荧光定量PCR法检测大鼠心肌组织NF-κB mRNA表达水平 取心肌组织剪碎研磨于1 mL的Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20 s提取总RNA。加入40 μL的DEPC水溶解RNA，置于-80 ℃冰箱保存备用。后反转录为cDNA，反应程序：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，5 min；置于-20 ℃保存。将制备好的cDNA进行PCR扩增。PCR扩增：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；0 ℃，45 s；40个循环。上下游引物序列见表1。以GAPDH基因作为内参基因，采用2-ΔΔC法分析NF-κB mRNA的相对表达水平。

表1 PCR引物序列及扩增长度

3 结果

3.1 模型复制前后大鼠心电图变化 正常组ST段电压为(0.134 3±0.004 64)mV，模型组ST段电压为(0.274 3±0.014 62)mV，与正常组比较，模型组大鼠的ST段电压抬高≥0.1 mV(

P

<0

.

05)，表明急性心肌缺血大鼠模型复制成功。3.2 各组大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平比较 与正常组比较，模型组大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平显著升高(

P

<0

.

05)；与模型组比较，即刻电针组大鼠血清IMA水平差异无统计学意义(

P

>0

.

05)，CK、CK-MB水平显著降低(

P

<0

.

05)，其余各电针组大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平逐渐降低，以电针7 d组降低最为显著(

P

<0

.

05)。见表2。

表2 各组大鼠血清CK、CK-MB、IMA水平比较

3.3 各组大鼠心肌组织NF-κB蛋白及mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白及mRNA表达水平显著升高(

P

<0

.

05)；与模型组比较，即刻电针组、电针1 d组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白及mRNA差异无统计学意义(

P

>0

.

05)；电针3 d、5 d、7 d组大鼠心肌组织中NF-κB蛋白及mRNA表达水平呈下降趋势，以电针7 d组下降最为显著(

P

<0

.

05)。见图1、表3。

注：A.正常组；B.模型组；C.即刻电针组；D.电针1 d组；E.电针3 d组；F.电针5 d组；G.电针7 d组

表3 各组大鼠心肌组织NF-κB蛋白及mRNA表达水平比较

4 讨论

急性心肌缺血可归属于中医学“胸痹”“心痛”“真心痛”等范畴。病位在心，主要病机为心脉痹阻。由于心脉闭塞，气血运行中断，心胸猝然大痛，而发为真心痛。心主血脉，能够主管脉动和推动血液的运行。《灵枢·经脉》记载，手少阴心经“起于心中，出属心系……下肘内，循臂内后廉，抵掌后锐骨之端”，是动则病“心痛”；又言其“是主心所生病者”。由此可知手少阴心经循行、病候和主治与心密切相关。《灵枢·九针十二原》记载：“五脏有疾，当取十二原。”神门穴为心经输穴和原穴，主治心病，现代常用于治疗心绞痛等疾病。针刺心经原穴对心功能的调节具有相对特异性，可以有效治疗心脏疾病。既往研究表明，电针心经“神门-通里”段能够治疗急性心肌缺血，有效改善心功能，对心脏具有保护作用。

本实验采用冠状动脉结扎法制备急性心肌缺血模型，心电图中ST段明显升高，表明动物模型复制成功。CK和CK-MB是诊断急性心肌缺血的重要心肌酶指标，两者同时检测有助于病情的诊断和分析，且对判断临床预后具有一定价值。IMA已经被广泛应用于心肌缺血的临床评判依据，是早期诊断心肌缺血的重要标志物。IMA的释放能够促进心肌细胞的炎症反应和氧化应激反应，从而影响病情的发展。本研究结果表明，急性心肌缺血大鼠血清CK、CK-MB、IMA升高，电针心经“神门-通里”段能够降低CK和CK-MB的活性和IMA的表达水平，从而起到减轻心肌损伤，保护心功能的作用。

NF-κB能参与机体防御反应、组织损伤和应激反应、细胞分化及凋亡，调控炎症反应，属于多种基因表达的调控转录因子。NF-κB的表达变化能反映参与炎症反应中细胞因子的变化，与心肌缺血疾病发生时所产生的氧自由基和心肌组织释放的炎症递质相关，是此病理过程中重要的调节因子，能够影响心肌缺血的进程。此外，心肌细胞的凋亡也与NF-κB的激活相关。马骏等研究发现，大鼠心肌缺血后心肌组织中NF-κB蛋白表达水平明显增加，使NF-κB活化。有研究发现，电针能够降低血清中炎症因子水平，进而调控下游炎症因子，从而下调NF-κB p65蛋白的表达水平。本实验结果表明，急性心肌缺血后大鼠的NF-κB的活化明显，电针刺激后，NF-κB蛋白及mRNA表达水平均下降，说明电针能够抑制其活化从而达到保护心肌的作用。

综上，电针心经能够通过逆转心肌组织NF-κB的表达而改善急性心肌缺血。在治疗第3天开始起效，治疗第7天时效果最明显。本研究结果表明，电针时间对急性心肌缺血大鼠心脏损伤具有一定的保护作用；实验结果表明的最佳时间可能为7 d，但针刺疗效是否随着时间延长而继续增加，这有待进一步的研究。由于现有的临床和基础实验条件不足，对于针刺时间仍缺少固定的量化标准。因此，在未来的临床应用中，也应注意针刺时效关系，从而获得更好的临床疗效。