新型脊柱外固定技术减少医源性脊旁肌损伤的动物模型研究

李珊，彭文,2，晏怡果，王程，宋西正，李学林 欧阳智华，薛静波，王文军

1.南华大学附属第一医院骨科研究所，湖南 衡阳 421001；2.佛山市骨科内置物（施泰宝）工程技术研究中心，广东 佛山 528200

交通事故及高处坠落伤常常合并胸腰椎骨折等脊柱创伤性疾病，传统的治疗方式大多采用开放内固定手术，但开放内固定手术中肌肉组织创伤大，出血多[1]，因此脊柱外固定手术应运而生。自1977年Magerl[2]首先设计并应用脊柱外固定器以来，国内外的外固定器结构大同小异[3～5]，均由椎弓根螺钉以及体外调节装置组成。但其复杂笨重的体外调节装置导致病人术后难以平卧；外露部件较大易致钉道感染，使其推广应用受到限制。为尽量减轻手术创伤和患者痛苦，南华大学附属第一医院脊柱外科团队根据Magerl 脊柱外固定器的三维复位原理，对椎弓根螺钉的调节装置和脊柱外固定器的框架固定结构进行重新设计，自主研发了新型脊柱外固定器（专利号：CN201310498699.4），使其在更容易实施体外撑开复位和弹性固定的同时尽可能简化其外部结构，降低复位器部分切迹后，该外固定系统外露部件高1 cm，术后以无菌敷料覆盖可降低针道感染几率，并不影响患者平卧，显著减少手术对患者生活带来的不便。迄今为止，该团队及合作医院对2000余例胸腰椎骨折患者应用了新型脊柱外固定器，其适应症主要包括：①经影像学确诊的胸腰椎新鲜爆裂性骨折，前中柱损伤为主（AO 分型A 型和B1/2型）；②椎管狭窄程度＜50%，且以椎体后缘平移为主；③椎体高度丢失＞30%，后凸畸形＞25 °；④虽有神经功能损害，但Frankel 分级为A 级的患者除外；⑤部分符合以上条件的多节段骨折[6]。通过临床随访以及相关基础研究，明确该技术能够满足胸腰椎骨折患者对骨折椎体撑开、提拉、撬拨复位等治疗效果的要求，其术后深部感染率远低于其他脊柱外固定技术[7]；由于该技术固定时间短，患者可早期下床功能锻炼，减少了应力集中和应力遮挡，术后内置物失败和邻近节段椎间盘退变等并发症发生率远低于传统开放手术，同时脊柱运动功能节段得以最大程度保留，大大降低患者术后腰背部疼痛的发生率[6,8～10]。基于大样本临床应用经验，本研究通过构建新型脊柱外固定技术以及开放内固定手术山羊动物模型，评估两种治疗方式对山羊脊旁肌损伤的影响，并阐明新型脊柱外固定器及其相关技术的作用机制[11,12]，期为脊柱外固定装置的优化升级和临床进一步推广应用提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象及分组 选取10只1岁左右、体重（20±2.0）kg 的山羊（健康雄性本地杂交山羊），随机分为脊柱外固定手术组、开放内固定手术组，每组5头。X 线透视检查排除骨病、骨畸形及外伤等特殊情况。实验动物均由南华大学实验动物学部统一采购管理。

1.1.2 主要设备 胸腰椎后路常用手术器械包、高频电刀仪、山羊胸腰椎后路专用手术台架、胸腰椎后路椎弓根钉棒系统、胸腰椎后路脊柱外固定系统（广东施泰宝医疗科技有限公司）、Achieva 3.0 T 超高场磁共振成像系统、WDW-100微机控制万能材料试验机（以下称试验机）、XL 2118 A 静态电阻应变仪（以下称电阻应变仪）、100 NS 型拉伸应力传感器（以下称拉伸应力传感器）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型构建 予以肌注0.02 ml/kg 鹿眠宁（盐酸塞拉嗪注射液）进行麻醉，麻醉满意后取俯卧位[13]。术中每30 min 肌注一次鹿眠宁0.01 ml/kg。术毕予以肌注同等剂量的陆醒宁（盐酸苯噁唑）催醒[14]。待山羊恢复自主意识后转运至羊舍，完全苏醒后可正常饮食[15,16]。（1）新型脊柱外固定技术。C 臂机透视确定山羊L3节段，于L2、L4双侧椎弓根体表投影位置置入克氏针并在C 臂机透视下调整至椎弓根螺钉置钉方向，用空心套筒沿克氏针方向置入并咬定骨面后拔出克氏针，通过空心套筒置入直径5.5 mm 的超长臂椎弓根螺钉，并在C 臂机透视下确认椎弓根螺钉位置良好。分别安装并锁定纵向连接棒与撬拨套件，调节其位置距山羊皮肤0.5～1 cm，剪除多余椎弓根螺钉尾端，用酒精纱布缠绕各螺钉与皮肤交界处，无菌敷料覆盖，见图1。（2）开放内固定手术。C 臂机透视确定山羊L3节段，做L1～5节段后路正中皮肤切口，沿棘突逐层暴露至椎板及小关节，以单齿拉钩撑开后路皮肤及脊旁肌肉，双关节钳咬除进钉点部位骨赘及部分骨皮质，在L2、L4双侧制备进钉通道，分别置入直径5.5 mm 的椎弓根螺钉4枚，C 臂机透视明确钉道角度合适。根据山羊腰椎曲度及长度，剪裁并预弯钛棒安装至椎弓根螺钉U 型槽内，螺帽锁死并加压固定，折断椎弓根螺钉多余尾端。双氧水及稀释络合碘反复冲洗伤口，逐层缝合后路肌肉、筋膜及皮肤，无菌敷料覆盖。

图1 山羊脊柱外固定手术后（左）及新型脊柱外固定器外观（右）应用新型脊柱外固定器手术仅有部分椎弓根螺钉置入体内，连接棒以及撬拨套件均位于体外，体外部分总高度为2～3 cm a.撬拨套件b.连接棒c.椎弓根螺钉Fig.1 After spinal external fixation in goats(left),Spinal external fixator products(right)After the operation,only part of the pedicle screws were implanted in the body.Other connecting rods and prying kits were located in vitro,and the total height of the external part was 2～3 cm; a, prying kit; b,connecting rod;c,pedicle screw

1.2.2 大体及影像学观察 术后3个月过量麻醉处死山羊，将手术节段腰椎（L1～5）整体取出，用生理盐水纱布包裹[17]，将手术节段标本分别行腰椎3.0 T 核磁共振（MRI）横断面、矢状面以及冠状面，手术节段周边各层面扫描[18]。使用Philips DICOM Viewer 3.0分别计算脊柱外固定手术组及开放内固定手术组横断面上脊旁肌各区域（手术区、螺钉区、钛棒区）T2平均值，进行统计分析[19]。

1.2.3 背最长肌准静态拉伸试验 完成影像学评估后，两组手术节段标本脊旁肌取材进行肌肉组织准静态拉伸实验。试验机的加载速度设置为2 mm/min，即为测试应变率，将所有标本进行应变率加载，分别连续记录数据直至测试条完全断裂。通过已获取的数据计算工程应力：σ=F/A，通过拉伸长度计算工程应变：ε=（L-L0）/L0，取平均值，通过σ与ε之间关系绘制应力-应变曲线，计算极限强度与破坏应变。通过以上数据计算杨氏模量：E=（F/S）/（L0/L）[20,21]。

1.2.4 病理组织学观察 脊旁肌准静态拉伸实验完成后，将测试条及其外侧保留完整肌肉划分为手术区域、螺钉区域、钛棒区域，分别将肌肉制备成边长约10 mm 的立方块，生理盐水清洗后置于4%的多聚甲醛中固定，石蜡切片，HE 染色及Masson 染色，根据HE 染色通过肌纤维横截面积量化分析肌肉组织病理变化[22,23]，通过Masson 染色评估肌肉组织内纤维增生以及炎性浸润程度。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 18.0进行统计学分析，计量资料以及等级资料评价指标以均数±标准差（）表示，若为正态分布且方差齐性，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD 法；若为非正态分布或方差不齐，采用多组比较的秩和检验，多重比较采用Kruskal-Wallis H 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物一般情况

开放内固定手术组1头山羊因术中麻醉监控不佳，出现躁动，导致高频电刀误入椎板间隙，术后脑脊液漏，颅内感染，救治无效死亡；脊柱外固定手术组1头山羊因术中经皮椎弓根螺钉误入椎管，导致双下肢瘫痪，大小便失禁，术后大剂量激素冲击治疗后，症状无明显好转，予以肌注过量麻药处死；其他实验动物顺利完成实验，未出现断钉、断棒及严重感染导致瘫痪或死亡。成功构建开放内固定手术与新型脊柱外固定技术动物模型各4头，如图2，术后饲养满3月后予以肌注过量麻药处死。

图2 新型脊柱外固定技术模型（左）与开放内固定手术模型（右）Fig.2 Gross images after spinal external fixation surgery(left)and open internal fixation surgery(right)

2.2 山羊脊旁肌大体标本观察

解剖两组山羊模型脊旁肌标本进行手术部位周边的大体观察，开放内固定手术组有大量的瘢痕组织包绕在椎弓根螺钉尾端及钛棒周围；脊柱外固定手术组仅螺钉周围出现少量的瘢痕组织，其他区域肌肉基本保持正常状态，如图3。

图3 模型山羊脊旁肌标本大体观察左：开放内固定手术组脊旁肌 椎弓根螺钉尾端及钛棒周围包绕大量瘢痕组织右：脊柱外固定手术组脊旁肌 仅螺钉周围出现少量瘢痕组织，其他区域肌肉基本正常a：钉孔b：结缔组织c：肌肉Fig.3 Open internal fixation surgery group(left),spinal external fixation surgery group(right)In the open internal fixation group,a large amount of scar tissue was wrapped around the end of the pedicle screw and titanium rod,while only a small amount of scar tissue appeared around the screw in the spinal external fixation surgery group,and the muscles in other parts remained basically normala,nail hole;b,connective tissue;c,muscle

2.3 山羊脊旁肌准静态拉伸试验

通过绘制两组模型山羊脊旁肌标本准静态拉伸应力-应变曲线，并根据其结果计算各标本的极限强度与破坏应变（表1），可明确开放内固定手术组各标本极限强度及破坏应变均小于脊柱外固定手术组，P＜0.05，有统计学差异。

表1 模型山羊脊旁肌准静态拉伸材料性能参数（,n=8）Tab.1 Performance parameters of goat paraspinal muscle quasistatic stretching material(Mean±SD，n=8)

表1 模型山羊脊旁肌准静态拉伸材料性能参数（,n=8）Tab.1 Performance parameters of goat paraspinal muscle quasistatic stretching material(Mean±SD，n=8)

2.4 模型山羊腰椎磁共振影像学观察

对两组手术节段脊旁肌标本进行3.0 T 磁共振扫描，各序列各截面背最长肌形态及信号进行无创的定性观察与分析，开放内固定手术组横断面及矢状面可见内固定装置周边存在大量结构显现不清的混杂信号，特别是螺钉外侧的肌肉组织中呈现代表损伤的高信号，而单纯受到手术暴露影响，未安装内置物的区域靠近棘突部位有少量的空隙存在，且周边组织信号稍有增强。而在新型脊柱外固定技术组，仅螺钉周围出现少量的肌肉损伤，其他部位肌肉基本保持正常状态，见图4。

图4 手术节段脊旁肌各区域磁共振扫描图像（T2W_TSE_DRIVE_HR）a：开放内固定手术组螺钉区b：脊柱外固定手术组螺钉区c：开放内固定手术组钛棒区d：脊柱外固定手术组钛棒区e：开放内固定手术组手术区f：脊柱外固定手术组手术区g：开放内固定手术组矢状面h：脊柱外固定手术组矢状面Fig.4 MRI of paraspinal muscles in different regions of operation segment(T2W_TSE_DRIVE_HR)a: screw area of open internal fixation surgery group; b: screw area of spinal external fixation surgery group; c: titanium rod area of open internal fixation surgery group; d: titanium rod area of spinal external fixation surgery group; e: surgical area of open internal fixation surgery group; f:operation area of spinal external fixation surgery group; g:sagittal plane of open internal fixation group; h: sagittal plane of spinal external fixation surgery group

对两组模型山羊双侧脊旁肌手术区、螺钉区、钛棒区各层面T2值共6组数据进行统计学分析（图5），结果表明，脊柱外固定手术组螺钉区均高于该组手术区与钛棒区，均P=0.00，手术区与钛棒区无统计学差异（P=0.36）；开放内固定手术组钛棒区与该组螺钉区无统计学差异（P=0.24），而其手术区与螺钉区以及钛棒区之间均有统计学差异（P=0.00）；脊柱外固定手术组与开放内固定手术组之间比较，脊柱外固定手术组螺钉区与开放内固定手术组钛棒区无统计学差异（P=0.07），两组其他区域之间均具有统计学差异。以上两两比较采用LSD 分析，F=30.41。

图5 手术节段脊旁肌各区域T2值Fig.5 Dorsal longest muscle T2 value data

2.5 山羊脊旁肌病理组织学观察

两组脊旁肌标本组织切片HE 染色结果见图6。通过Image J 软件计算各组各区域背脊旁肌肌纤维横截面积并进行统计学分析（图7），结果显示，脊柱外固定手术组螺钉区肌纤维横截面积均高于该组手术区与钛棒区，具有统计学差异（P=0.02、0.03），该组手术区与钛棒区无统计学差异（P=0.88）；开放内固定手术组钛棒区与该组螺钉区之间无统计学差异（P=0.20），该组手术区与螺钉区以及钛棒区之间均有统计学差异（P=0.00、0.04）；脊柱外固定手术组与开放内固定手术组之间比较，脊柱外固定手术组螺钉区与开放内固定手术组手术区无统计学差异（P=0.78），两组其他各区域之间均具有统计学差异。以上两两比较采用LSD 分析，F=11.827。

图6 手术节段脊旁肌各区域HE 染色图像 开放内固定手术组螺钉区以及钛棒区肌纤维之间及肌束之间间隙明显增宽，单肌纤维的横截面积增大，提示该区域肌肉组织为损伤状态 开放内固定手术组手术区与脊柱外固定手术组各区域其肌束基本无萎缩或有少量萎缩，肌纤维之间及肌束之间的组织间隙较小，肌束周边界限清晰，肌纤维横截面基本呈多边形，未出现横截面变圆、肌纤维明显萎缩及肿胀，提示该区域肌肉组织为正常状态或损伤尚不严重Fig.6 He staining images of paraspinal muscles in different regions of the operation segment;In the open internal fixation group,the muscle tissue in screw area and titanium rod area showed that the tissue gap between muscle fibers and between muscle bundles was significantly widened,and the cross-sectional area of single muscle fiber was increased,indicating that the muscle tissue in this area was in a state of injury;However,in the open internal fixation group and the spinal external fixation group,there was no atrophy or a small amount of atrophy in the muscle tracts,the tissue gap between the muscle fibers and between the muscle tracts was small,and the boundary of the muscle tracts was clear.At the same time,the cross-section of muscle fiber was polygonal,and there was no cross-section roundness,muscle fiber atrophy and swelling,suggesting that the muscle tissue in this area was normal or the injury was not serious

图7 脊旁肌各区域肌纤维横截面积Fig.7 Transection area of paraspinal muscle fibers

两组脊旁肌标本组织切片Masson 染色结果见图8。通过Image J 软件分别计算同一张切片视野内肌纤维（红色）以及胶原纤维（蓝色）的面积，计算其面积比值S肌肉/S纤维进行统计学分析（图9）。结果表明，脊柱外固定手术组螺钉区脊旁肌Masson 染色比值均低于该组手术区与钛棒区，具有统计学差异（P=0.00），该组手术区与钛棒区之间无统计学差异（P=0.53）；开放内固定手术组钛棒区与该组螺钉区之间无统计学差异（P=0.14），该组手术区与螺钉区以及钛棒区之间均有统计学差异（P=0.00）；脊柱外固定手术组与开放内固定手术组之间比较，脊柱外固定手术组螺钉区与开放内固定手术组钛棒区无统计学差异（P=0.10），两组其他各区域之间均具有统计学差异。以上两两比较采用LSD 分析，F=152.23。

图8 手术节段脊旁肌各区域Masson 染色图像；在开放内固定手术组螺钉区、钛棒区以及脊柱外固定手术组螺钉区发现肌肉组织内存在大量稀疏的纤维组织以及部分炎性组织，同时在部分损伤严重的肌肉组织内，甚至能够看到部分肌细胞表现为蓝染；在开放内固定手术组手术区以及脊柱外固定手术组手术区、钛棒区中则纤维组织形态规则且未浸润至肌肉组织内部，肌细胞表现为形态规则的红色多边形，未发现有细胞蓝染。Fig.8 Masson stain of longest dorsal muscle Masson staining images of paraspinal muscles in different regions of operation segment;In the screw area and titanium rod area of open internal fixation group and the screw area of the spinal external fixation group,there were a large number of sparse fibrous tissue and some inflammatory tissue were found and some muscle cells were even blue stained in some severely injured muscle tissues;In the operation area of open internal fixation group and the operation area and titanium rod area of the spinal external fixation group,the fibrous tissue was regular in shape and did not infiltrate into the muscle tissue.The muscle cells showed regular red polygon in shape,and no blue staining was found.

图9 背最长肌各区域Masson 染色肌纤维与胶原纤维面积比值Fig.9 Masson staining ratio data for the longest dorsal muscle

3 讨论

3.1 不同手术方式对脊旁肌的影响

本研究制作动物模型对比新型脊柱外固定技术与内固定手术对脊旁肌的影响，通过对手术节段脊旁肌进行大体观察和影像学分析发现，开放内固定手术组肌肉组织损伤相对严重，内固定节段的棘突旁几乎没有正常组织附着，大量无肌肉功能的瘢痕组织形成；而外固定手术组除螺钉周围出现少量瘢痕组织，其他部位肌肉基本保持正常状态。因此认为脊柱外固定手术能够避免脊旁肌的剥离，减少因棘突上及小关节突周围的部分肌腱韧带复合体的一并切除所带来的脊旁肌损伤，这与既往临床资料的分析结果基本一致[24]。

本实验还发现开放内固定手术组其外侧相对正常的脊旁肌磁共振图像上表现为损伤或炎性的高信号影，T2量化后参数明显增高，这与相应的肌肉组织学染色形态研究基本一致，部分损伤较为严重的肌肉组织出现肌纤维之间及肌束之间的组织间隙明显增宽，肌纤维结构混杂，单肌纤维的横截面积增大。而外固定手术组则除螺钉周围出现少量瘢痕组织，其他部位肌肉基本保持正常状态，磁共振检查也仅有少量高信号影，组织形态学上并无过多改变。本研究通过准静态拉伸实验绘制两组肌肉组织的应力-应变曲线发现，无论是在极限强度、破坏应变以及弹性模量上脊柱外固定手术组的残余肌肉组织均明显优于内固定组[25,26]，这也进一步说明脊柱外固定手术相较于内固定手术能够更好地保护脊旁肌的生物力学功能。

3.2 胸腰椎后路手术导致脊旁肌损伤机制

通过大体观察、磁共振分析、生物力学测试以及组织学观察，本研究明确了在脊旁肌保护意义上，脊柱外固定手术明显优于内固定手术[27]。同时发现各组内部比较，其不同区域的肌肉损伤程度并不相同，可能是由于肌肉组织受到不同程度的人为因素干预所致。为便于分析术中脊旁肌医源性损伤因素，本实验对开放内固定手术节段的肌肉组织进行分区：受到手术操作以及螺钉留存影响的肌肉组织为螺钉区，受到手术操作以及钛棒留存影响的肌肉组织为钛棒区，仅受到手术操作影响的为手术区；外固定手术也与之对应划分区域[28]。结果发现在内固定组手术区，其肌肉组织相对完整，存在少量肌肉组织重新附着在棘突上，但粘附并不紧密，其磁共振扫描结果以及组织学观察同样支持该区域的肌肉组织基本恢复正常状态。内固定组螺钉区与钛棒区则表现为大量瘢痕组织形成，其磁共振表现为脊旁肌存在大量表示损伤或炎性的高信号影，组织学表现为肌纤维之间及肌束之间的组织间隙明显增宽，肌纤维结构混杂，单肌纤维的横截面变圆、肌纤维明显萎缩或水肿，出现明显核内移现象，少量肌纤维呈现波浪状（图10）。在肌纤维横截面积的量化评估中，损伤严重的分区其肌纤维横截面积明显大于其他各组，同时其数据的标准差也相应变大。这与既往文献所述脊柱融合术后出现腰背部肌肉失神经支配导致肌肉萎缩的组织形态学改变不同，这种表现应为无菌性炎症所致肌纤维损伤。特别是Masson 染色能够在部分肌细胞内看到蓝染（图10），更加直接说明了这部分肌细胞因严重损伤或炎性反应，导致肌细胞膜通透性增加，大分子的苯胺蓝染料可以通过肌细胞膜。而开放内固定手术组中除螺钉区肌肉组织表现有一定的组织损伤外，其他未直接接触内置物的肌肉组织均呈正常肌肉组织表现[29,30]。因此认为开放内固定手术组大部分的肌肉损伤是因为内固定装置长时间留置体内，对周边肌肉组织产生长时间骚扰与挤压而导致慢性无菌性炎症[31]。综上所述，新型脊柱外固定技术相较于传统开放内固定手术，通过经皮超长臂椎弓根螺钉置钉以及改进外置固定，可避免术中广泛剥离导致的肌腱韧带复合体损伤，同时减少术后由于内固定装置挤压和干扰引发慢性炎性反应所导致的脊旁肌损伤。

图10 损伤严重的肌肉组织HE 染色（左）与Masson 染色典型表现（右）左：HE 染色肌细胞同时表现为细胞萎缩以及细胞水肿，并且部分细胞能够观察到典型的核内移现象 右：Masson 染色肌细胞出现明显的炎性反应，表现为肌细胞蓝染Fig.10 Typical performance of HE staining(Left figure) and Masson staining(Right figure) of severely damaged muscle tissueHE staining showed that myocytes showed atrophy and edema at the same time,and some cells could observe the typical phenomenon of nuclear translocation;Masson staining showed obvious inflammatory reaction in muscle cells,which showed blue staining