CIP2A在类风湿性关节炎中的作用

丁亚云，祁 昌

（苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006）

类风湿性关节炎是一种病因未知的慢性自身免疫性炎症性疾病，主要累及手部与足部的小关节，大关节也常受累及。目前类风湿性关节炎已经成为造成人类丧失劳动力的主要疾病之一。类风湿性关节炎的发病机制复杂，在IL-1β、IL-6及TNF-α等炎症因子的刺激下，免疫系统被激活，滑膜组织中各种免疫细胞浸润，滑膜组织被刺激后明显增生，造成类风湿性关节炎的早期病变形成。类风湿性关节炎主要的治疗途径为药物治疗，如抗炎药物、激素、免疫抑制剂、生物制剂等治疗[1-3]，尽管国内外关于类风湿性关节炎的研究越来越深入，其致病机理至今未明。这就要求人们进一步深入研究类风湿性关节炎的致病机理，为类风湿性关节炎提供更加有效的治疗靶点。

蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A, CIP2A）是2000年科学家克隆出来的基因片段，编码的靶蛋白主要定位在人类肿瘤细胞的细胞质内[4]。目前为止，已在人类许多恶性肿瘤组织内发现CIP2A蛋白的过表达[5-7]，研究发现CIP2A与细胞的增殖密切相关，而类风湿性关节炎的病理改变主要发生在滑膜衬里层，而构成衬里层主要的成纤维样滑膜细胞在类风湿性关节炎疾病的发展中起关键作用，活化的成纤维样滑膜细胞可以产生新的生物学特性，如过度增殖、细胞侵袭及凋亡耐受等[8-10]，有趣的是CIP2A对多数增殖的细胞中起重要作用[11-15]，本研究目的就是探讨CIP2A在类风湿性关节炎滑膜中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 小鼠CIA模型的制备 无菌条件下通过3 mL冰乙酸中溶解12 mg牛Ⅱ型胶原（CⅡ），CⅡ浓度为4 mg/mL溶液。将3 mL福氏完全佐剂与3 mL上述配置溶液同比例混合，再取所得混合液100 μL经小鼠皮内注射，且在21 d后再次免疫。足趾厚度通过游标卡尺进行测量。每两天测1 次关节炎评分与足趾厚度，通过两名实验人员独立完成操作。

1.2 H&E染色判断炎症浸润程度 将模型鼠及正常鼠的关节取出固定在多聚甲醛中24 h，24 h后将各组的小鼠标本放在EDTA脱钙液中进行脱钙1 个月时间，待小鼠的关节组织右手弯曲后可以达到120°时，将关节进行梯度脱水及浸蜡，将脱好水的标本进行石蜡包埋，放置冷却台上进行冷却，在蜡块达到一定的硬度后，将其切成4 μm的片子，如果脱钙未完全可以再次重复脱钙，直至完全脱钙，然后将切好的片子进行烘片，烘片15 min后将片子进行HE染色，最后在显微镜下进行炎症严重程度评估。

1.3 PCR 将正常小鼠及模型的滑膜组织从膝关节中取出，用Trizol裂解法将RNA提取出来，检测RNA的浓度，将RNA定量至1 μg的体系进行逆转录，PCR实验所用的引物由primer bank查找，在NCBI的网页中进行比对，亦可以用Primer 3软件进行设计，最后由上海生工公司进行合成，具体序列为：CIP2A-F ctg tcg ggg tac tcc ctt gta，CIP2A-R tct act tgc cga gca agg ct，通过实验获得最佳的PCR体系，最后将逆转录好的cDNA进行荧光定量PCR。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0软件进行统计分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

CIP2A是重要的原癌基因，在乳腺癌、肠癌及膀胱癌等多种肿瘤中高表达，研究表明CIP2A的表达增高与细胞的生长增殖密切相关。滑膜增生是类风湿性关节炎最主要的病理特征之一，骨关节在长期炎症的刺激下，关节间质组织会代偿增生修复，但是滑膜过度增生又会加重类风湿性关节炎的骨质破坏，滑膜细胞在炎症因子的刺激下，细胞的生物性状改变明显，滑膜细胞出现肿瘤样生长，增生侵袭周围骨质。本课题首先利用CⅡ人皮下注射DBA小鼠诱导类风湿性关节炎，我们成功构建了类风湿性关节炎的小鼠模型（图1A），为进一步明确类风湿性关节炎模型鼠的病理特征改变，我们对小鼠的关节组织进行了HE染色（图1B），其结果显示，类风湿性关节炎模型组的小鼠关节出现了明显破坏，关节面毛糙，骨质破坏明显，炎症细胞浸润，滑膜增生，反映了类风湿性关节炎的典型病理表现，另外我们应用荧光定量方法检测了CIP2A分子表达情况，结果发现CIP2A分子在滑膜中表达增高（图1C），根据以上结果我们推测CIP2A的高表达可能与滑膜增生有关，其可能参与了类风湿性关节炎的进展。

图1 CIP2A在类风湿性关节炎组织中表达增高。A：CⅡ皮下注射给DBA小鼠诱导类风湿性关节炎小鼠；B：取DBA类风湿性关节炎模型鼠的关节部位，进行固定脱水包埋等，并将蜡块进行HE组织染色，相比较正常的DBA小鼠，类风湿性关节炎模型鼠的HE染色显示骨组织破坏明显，关节面粗糙，软骨破坏严重；C：荧光定量PCR检测CIP2A在滑膜中的表达；实验组及对照组小鼠均为5 只，P＝0.0028。

3 讨论

类风湿性关节炎是一种病因未知的慢性自身免疫性炎症性疾病，主要累及手足部的关节，大关节也常受累及。其主要的发病机理为免疫系统被激活后免疫细胞的浸润、滑膜组织的异常增生侵袭及骨质的破坏。美国疾控中心曾统计过类风湿性关节炎在全球的发病率0.5%～1%，而我国类风湿性关节炎的发病率0.32%～0.36%。类风湿性关节炎除了致残和降低生活质量，还可能加速动脉粥样硬化的过程，大大缩短患病人群的预期寿命[16]。

类风湿性关节炎的发病机制复杂，该病具有遗传易感性，一些基因如HLA-DRB1及其同位基因是该疾病最重要的相关基因[17]，在固有免疫及适应性免疫应答被激活后，在各种炎症因子的长期慢性刺激下，滑膜组织中炎性细胞浸润，滑膜组织增生，造成类风湿性关节炎的早期病变形成。尽管国内外关于类风湿性关节炎的研究越来越深入，其致病机理至今未明。虽然类风湿性关节炎患者的预后在现代化的治疗途径下已经有了很大的改善，但致残率仍然非常高。这就要求人们进一步深入研究其致病机理，为类风湿性关节炎提供更加有效的治疗靶点。

既往很多文献显示CIP2A在多种肿瘤中表达明显增高[18-20]，且与肿瘤的进行性进展明显相关，在体验研究中我们将CIP2A分子敲降后，很多细胞株的增殖水平显著下降，这些结果均提示我们CIP2A分子与细胞的增殖密切相关，而在类风湿性关节炎中成纤维样滑膜细胞在炎症因子刺激下，处于活化状态，增殖能力显著增强，于是我们构建了类风湿性关节炎的小鼠模型，并对造模后的小鼠模型进行HE染色、病理鉴定，我们通过提取模型组与正常组小鼠中的滑膜组织，将其裂解，荧光定量检测滑膜中CIP2A分子的含量，结果显示CIP2A分子在模型组的滑膜组织中显著增高，有效提示CIP2A分子很可能参与到成纤维样滑膜组织的增殖及活化中，我们推测CIP2A分子可能参与了类风湿性关节炎的发生与发展。