SMARCAD1在胃癌中的表达及其临床意义

钱 欢，姚一舟，朱新国

（苏州大学附属第一医院，江苏 苏州 215006）

胃癌是一种全球性的重要疾病。据估计，胃癌每年新增病例超过100万 例，是全球第五大被诊断为恶性肿瘤的疾病。由于胃癌的诊断往往处于晚期，其死亡率很高，成为癌症相关死亡的第三大原因[1]。

由于胃癌早期很少引起症状，胃癌的早期诊断主要依靠内镜及病理结果，缺乏无创又有效的早筛手段，大多数病例确诊时已为进展期或晚期，这些因素导致了胃癌的不良预后，主要治疗手段仍然是以手术治疗为主，大多数国家的5 年生存率在20%～40%[2-3]。胃癌依然是一个巨大的临床挑战。

近年来，遗传生物标记物开始在肿瘤的诊断与预后评估中发挥越来越重要的作用。因此，有必要研究新的生物标志物来预测胃癌的预后，以帮助改善胃癌的预后和治疗。

人类DNA每天都会暴露在各种有害的、破坏性的事件中，这些都会导致DNA损伤，可能会导致有害的遗传事件。人类细胞已经进化出一种称为DNA损伤反应的机制，它检测、发出信号并修复双链损伤引起的DNA损伤，以防止基因组损伤和随之而来的疾病。受损的DNA在染色质网络中通过几种机制修复，如DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和ATP依赖的染色质重塑复合物对核小体的重塑[4]。

所有染色质重塑复合体都含有SWI2（Switch 2）/SNF2（Sucrose Non-Fermenting 2）超家族的ATP酶/解旋酶，它通过ATP的水解为染色质重塑提供能量[5]。

SWI/SNF最先在酵母中被描述，因为它在SWI和SNF中起关键作用。它是一个由超过15 个亚基组成的大型复合体，包括SMARCA2、SMARCA4、SMARCAB1、SMARCAD1等，它们是哺乳动物基因表达调控所必需的。SWI/SNF亚基与人类疾病密切相关，特别是与癌症。已发现它们在近20%的人类肿瘤中发生突变，其中，SWI/SNF复合体的两个ATP酶SMARCA2和SMARCA4常与胰腺癌等恶性肿瘤相关。最近的研究表明，SMARCA2（BRM）在体内外促进胰腺癌细胞的生长，但抑制其对化疗的敏感性[6]。

SMARCAD1基因位于染色体4q22.3上，属于染色质重构体INO80家族[7]。在恶性肿瘤中，SMARCAD1过表达与多种癌症有关，包括皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌和胰腺癌，而在胃癌中则缺少有研究。

在本研究中，我们通过分析GEO数据库探讨SMARCAD1表达与胃癌临床病理特征和患者预后的相关性。

1 材料和方法

1.1 数据收集 在这个研究中，我们从基因表达总览数据库（GEO）收集了433 例胃癌的测序数据及临床信息。临床信息包括性别、年龄、T分期、N分期、生存状态、生存时间（术后随访至2020年4月或死亡）。这些数据来自GSE84433和GSE84426数据集。获取数据后我们再使用Perl软件和R软件中的impute和limma软件包，分别进行数据的注释和矫正。

1.2 微阵列分析 使用Affymetrix Human Genome 133 plus 2.0获得基因表达数据。微阵列实验和数据归一化的所有设计和质量控制均符合Affymetrix标准协议。按照胃癌患者的SMARCAD1表达值的中位数将数据分为两组，高于中位数的，均为SMARCAD1high组，其余均为SMARCAD1low组。差异倍数（foldchange，log2）＞0.5或＜－0.5用于确定差异表达基因。

1.3 统计分析 采用R软件3.6.2及SPSS 22.0进行统计分析。根据SMARCAD1表达的中位数将样本分为两组（SMARCAD1high，n＝215，SMARCAD1low，n＝218）。用limma软件包进行差异基因表达分析。采用t检验行两组间比较。运用卡方检验分析临床病理参数与目的基因表达量的关系。生存分析中采用Kaplan-Meier法评估。运用比例风险回归模型评估与预后相关的因素。均为双侧检验，显著性检验水平P＜0.05。

1.4 富集分析 GO富集分析通过从生物学过程、细胞组成和分子功能三个方面来研究SMARCAD1及其差异基因的生物学特性。采用KEGG富集分析方法对SMARCAD1和差异表达基因进行分析，寻找可能的生物学途径。并分别绘制气泡图。上述富集分析在R语言软件下完成，q值（q为校正P值）＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆中SMARCAD1表达与胃癌临床因素的关系 共有433 例原发性胃癌患者的临床病理特征纳入了本次研究。我们将所有的患者分为高表达组（n＝215）和低表达组（n＝218）。如表1所示，无淋巴结转移的患者SMARCAD1表达较高，淋巴结阳性的患者往往其SMARCAD1表达较低，提示SMARCAD1的表达与肿瘤的淋巴结转移相关（P＜0.05）。而SMARCAD1的表达与肿瘤的进展也呈负相关，进展期（T3-4）患者较早期（T1-2）患者血浆中SMARCAD1的表达量低（P＜0.05）。而其他病理因素如年龄、性别与SMARCAD1的表达未见明显相关。将SMARCAD1表达量与N分期、T分期进行相关性分析，结果如图1A、B所示，随着N、T分期的增加，SMARCAD1的表达水平呈下降趋势。

表1 SMARCAD1表达与433 例胃癌患者临床特征的关系（例）

图1 SMARCAD1在胃癌不同分期中的表达。X轴表示分期阶段，Y轴表示SMARCAD1表达式值（Log2）。A：随着N分期的增加，SMARCAD1的表达水平呈下降趋势，其中N0最为显著。B：SMARCAD1的表达水平随着T分期增加而下降，T1至T3期较为显著。

2.2 胃癌患者血浆SMARCAD1表达与预后的相关性分析 Kaplan-Meier分析结果表明SMARCAD1高表达的患者的总生存期比SMARCAD1低表达的患者更长（P＜0.001）（图2）。该结果提示其SMARCAD1有可能可以作为预测疾病生存的生物学指标。单因素及多因素分析发现胃癌患者总生存的危险因子包括淋巴结转移、T分期、N分期和年龄（图3A）。多因素回归分析结果提示血浆中存在SMARCAD1是胃癌总体生存的一个独立预测保护指标（P＜0.001）（图3B）。

图2 根据SMARCAD1表达水平分组，Kaplan-Meier分析433 例胃癌患者的总生存期

图3 单因素（A）和多因素（B）Cox回归分析胃癌患者预后因素

2.3 胃癌患者的差异基因 根据SMARCAD1表达的中位数将样本分为两组，以|Foldchange|＞0.5且P＜0.05的标准筛选出差异基因，用R软件绘制火山图（图4A）。通过对GEO数据集（GSE84433）中差异基因进行分析，结果显示有81 个差异基因，其中有22 个基因在胃癌患者血浆中存在高表达，而下调的基因有59 个。选取其中差异最显著的40 个基因利用R软件绘制热图（图4B）。

图4 差异表达基因（Deg）及GO富集和KEGG途径分析结果。A：SMARCAD1high和SMARCAD1low之间DEGS表达的火山图。Degs显著性的截断值标准为P＜0.05，log2倍数绝对值变化＞0.5。Y轴显示每个基因的－log10P值，而X轴显示该基因相对于FCER1G表达的log2倍变化。绿点代表81 个下调的基因，红色圆圈代表22 个上调的基因，黑点代表不显著的基因。B：热图显示了20 个上调基因和20 个下调基因。红色代表高表达，白色代表中间表达，蓝色代表低表达。C、D：KEGG和GO结果显示差异表达基因。X轴代表基因比率，Y轴代表不同的富集途径。

2.4 富集分析 通过对SMARCAD1及其40 个差异基因进行富集分析，在GO的生物学过程中，大部分差异基因富集于白细胞的趋化迁移、细胞外结构组织、细胞外基质组织、细胞-底物黏附的正向调节（图4D）。通过KEGG分析，黏着斑、PI3K-Akt信号通路和细胞外基质-受体相互作用是最丰富的途径（图4C）。

3 讨论

我们分析了SMARCAD1与胃癌临床病理参数是否存在关联，发现患者的性别、年龄与SMARCAD1的表达无关。其异常表达与淋巴结转移、T分期有关。并根据临床相关性分析我们发现，如患者存在SMARCAD1表达下调，其淋巴结转移阳性可能性增大，并提示疾病已处于进展期。这些结果提示其可能与胃癌演进存在关系，随着肿瘤进展，其表达水平愈低。Kaplan-Meier分析结果表明，胃癌患者血浆中SMARCAD1低表达预示着总生存时间明显缩短。Cox回归分析发现SMARCAD1可作为预测胃癌患者预后的临床独立预测因素。通过GO及KEGG分析，我们发现SMARCAD1及其差异基因作用于细胞黏附作用、PI3K-Akt信号通路和细胞外基质-受体相互作用。

黏着斑指的是细胞外基质与一个细胞的肌动蛋白细胞骨架之间的物理联系，通过黏着斑激酶触发活性进而发挥作用，调控细胞黏附信号。黏着斑激酶是肿瘤微环境中细胞信号的多功能调节因子。在各种肿瘤的发育过程中，黏着斑激酶通过激酶依赖和非激酶依赖的机制促进细胞的运动、存活和增殖[8]。实验表明黏着斑激酶mRNA水平在浆液性卵巢肿瘤和浸润性乳腺癌中升高，并且这些升高的mRNA水平与患者总体生存率较差有关，在胃癌中仍少有研究。

PI3K/AKT/mTOR信号通路是细胞内最重要的信号通路之一，它调节细胞的存活、生长、分化、细胞代谢和细胞骨架的重组。到目前为止，在人类癌症中发现的两种最广泛的PI3K-Akt激活机制是由受体酪氨酸激酶（RTK）和信号通路特定元件的体细胞突变触发的。该通路的异常刺激与肿瘤生长、血管生成和生存有关[9]。PI3K通路的修饰与大多数癌症的发病机制密切相关。因此，以这一途径的效应器为靶点是一种很有前途的治疗方法。

细胞外基质-受体相互作用通路是基因丰富的信号通路中表达上调最多的通路。它们在肿瘤脱落、黏附、降解、运动和增殖过程中起重要作用[10]。细胞外基质在其他癌症中的作用已经被证明。细胞外基质在前列腺癌组织中上调，并参与胃癌的肿瘤侵袭和转移过程。大肠癌中的细胞外基质可以促进癌细胞上皮-间充质转化（EMT）的发展。胶质母细胞瘤是最致命的成人脑瘤。表现为异常新生血管和肿瘤细胞弥漫性浸润的病理特征。细胞外基质和胶质母细胞瘤微环境之间的相互作用在这一进展中非常重要[11-12]。

本研究中仍存在一些不足：(1)纳入样本量相对较小，可能致使统计学效能较小；(2)本研究未对SMARCAD1在胃癌中具体机制进行研究；(3)未能进行系统的细胞学实验研究。

综上所述，在胃癌中，SMARCAD1表达量的降低可能暗示着疾病的进展及不良预后，并主要在细胞黏附、PI3K-Akt信号通路和细胞外基质-受体相互作用上发挥作用。SMARCAD1可作为辅助诊断和预后判断的生物标记物，未来可考虑进一步扩大样本量进行验证，进一步探讨SMARCAD1在胃癌发病机制中的作用。