石杉碱甲通过阻断Aβ-ABAD 复合物诱导的线粒体损伤改善APP/PS1 小鼠认知和记忆功能障碍的研究

陈庆状 马艳娇 范仪圻 侯添志 肖晓丹

AD 主要导致认知和记忆功能进行性衰退［1］。线粒体Aβ 已被证明是AD 发病机制中必不可少的神经毒性物质。AD 患者和APP/PS1 小鼠的线粒体中Aβ的积累会导致线粒体呼吸链活性减弱［2］。ABAD 也称为17β-HSD10,对维持线粒体能量产生的稳定状态起着至关重要的作用。然而,研究发现Aβ 和ABAD 形成的复合物会诱导ABAD 结构异常,从而阻止ABAD与NAD+结合,导致ABAD 无法发挥酶促活性［3］。因此,Aβ-ABAD 复合物可加剧Aβ 诱导的线粒体和神经元功能障碍［4］。HupA 已经被广泛应用于痴呆相关的疾病,是一种具有疾病改善型的AD 治疗药物［5］。HupA 通过减少APP/PS1 小鼠脑内Aβ 与ABAD 复合物的形成而改善脑细胞线粒体功能,从而降低Aβ 诱导的细胞毒性作用［6］。但HupA 是否可进一步改善AD 小鼠的认知和记忆功能尚不得而知。因此,本研究将HupA 腹腔注射6 个月后,观察AD 模型小鼠的认知和记忆功能改变情况,并进一步阐明阻断Aβ-ABAD复合物诱导的线粒体损伤是否在HupA 改善AD 小鼠认知和记忆功能障碍中发挥作用,为拓展HupA 的临床应用提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性AD(APP/PS1)小鼠,体重20～ 30 g。

1.2 主要试剂及材料 ATP 试剂盒,ABAD、兔抗Aβ 免疫球蛋白(Ig)G 和β-肌动蛋白(β-actin)一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。

1.3 主要方法

1.3.1 实验分组 ①AD-HupA 组:月龄为2 个月的AD 小鼠每天腹腔注射HupA(0.1 mg/kg)持续6 个月；②WT-HupA 组:月龄为2 个月的WT 小鼠操作同“①”；③AD-溶媒组:月龄为2 个月的AD 小鼠每天腹腔注射生理盐水持续6 个月；④WT-溶媒组:月龄为 2 个月的WT 小鼠操作同“③”；⑤AD-他克林组:月龄为2 个月的AD 小鼠每天腹腔注射他克林(0.5 mg/kg)持续6 个月［6］。

1.3.2 离散型脑细胞(dissociated brain cells,DBCs)的提取 小鼠断头取脑,大脑半球用预冷PBS洗涤,吹散,离心后弃上清。重悬上一步得到的细胞沉淀,离心后弃上清,重复上述操作2 次后,得离散型细胞。

1.3.3 ATP 水平检测 收集每组DBCs 后,加入100 μl ATP 释放剂,加入荧光素底物和荧光素酶避光孵育 10 min,Perkin Elmer 酶标仪检测生物发光强度［7］。

1.3.4 免疫共沉淀法检测Aβ-ABAD 复合物蛋白水平 提取小鼠脑细胞线粒体,加入Tris 缓冲液,在4℃下14000×g 离心5 min。上清液加入兔抗Aβ IgG 一抗4℃孵育过夜,再加入蛋白质A 琼脂糖珠20℃孵育2 h。然后再进行Western blot 操作。

1.3.5 Morris 水迷宫实验 小鼠给药后进行Morris 水迷宫实验。训练试验连续进行5 d,4 次/d。在第6 天的测试实验中,移除平台,记录小鼠进入目标象限的次数、在该象限中所花费的总时间和每只小鼠速度。2 h后,更换平台并评估动物在90 s 内找到平台的能力。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD 法)。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HupA 改善AD 小鼠线粒体障碍 与WT 对照组相比,AD 组的ATP 水平显著降低(P＜0.01),HupA 处理后可显著逆转AD 小鼠ATP 的下降趋势(P＜0.01),但他克林没有此效应(P＞0.1)。见图1A。

图1A HupA 改善AD 小鼠线粒体障碍(n=4)

2.2 HupA 减少Aβ-ABAD 复合物水平 与WT 对照组相比,AD 小鼠Aβ-ABAD 复合物水平大幅升高(P＜0.001),经HupA 治疗后显著降低了Aβ-ABAD 复合物的水平(P＜0.001)。然而,他克林治疗组的Aβ-ABAD 复合物水平并未显著降低(P＞0.1)。提示HupA与AD 小鼠大脑中线粒体Aβ-ABAD 复合物水平的降低有关。见图1B。

图1B HupA 减少Aβ-ABAD 复合物水平(n=4),aP＜0.01,bP＜0.01

2.3 HupA 改善AD 小鼠认知和记忆障碍 与AD 组相比,HupA 处理的AD 小鼠穿越平台次数和所在目的象限时间百分比有显著性提高,表明HupA 可改善AD模型小鼠的认知和记忆功能障碍。而他克林虽也可改善AD 小鼠的空间认知和记忆能力,但差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 HupA 改善AD 小鼠认知和记忆障碍()

3 讨论

Aβ 诱导的神经细胞线粒体功能障碍是引起AD 的主要病理机制［8］。Aβ 与ABAD 的结合会抑制ABAD 的酶活性,进一步导致线粒体ATP 产生不足［3,6］。本研究显示,未经HupA 处理的AD 小鼠的DBC 中ATP 水平显著降低。而经HupA 处理后,ATP水平明显升高。提示HupA 对AD 小鼠脑细胞线粒体具有保护作用。但是,他克林组未发现对线粒体功能的保护作用。

AD 患者及AD 小鼠大脑中ABAD 蛋白表达明显增加,ABAD 可加重AD 患者和AD 小鼠中Aβ 诱导的线粒体功能障碍［3,9］。本研究提示,AD 小鼠脑细胞中Aβ 和ABAD 的复合物形成水平显著增加,而HupA显著减少复合物的形成。这些结果表明,HupA 显著降低AD 小鼠的ABAD 蛋白水平,从而降低Aβ-ABAD复合物的水平。

综上结果提示,HupA 可通过减少Aβ-ABAD 复合物的形成改善AD 小鼠脑细胞线粒体损伤。

本研究进一步采用Morris 实验检测HupA 是否能改善AD 小鼠的认知和记忆能力。结果提示,与WT小鼠相比,AD 小鼠的认知和记忆能力显著降低,而HupA 可明显改善AD 小鼠的认知和记忆能力。他克林组虽也能改善AD 小鼠的认知和记忆能力,但统计学没有显著性差异。Liang 等［10］的研究也显示他克林相对HupA 在改善AD 患者认知功能方面并不具优势。但最近的研究表明,在抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)之前,HupA 已被证明可改善线粒体功能和记忆丧失［8］。这也与本研究的结果相符,相比他克林,HupA 除了具有AChE 抑制剂活性外,还能发挥线粒体保护作用。因此推测,HupA 减少Aβ 和ABAD 复合物诱导的线粒体功能障碍在减轻AD 小鼠的认知和记忆功能障碍中起着不可或缺的作用。

总之,HupA 可通过减少Aβ 与ABAD 的结合来发挥线粒体保护作用,且极可能与进一步改善AD 小鼠的认知和记忆功能障碍有关。研究结果揭示了HupA在治疗AD 中的独特药理作用机理,并为进一步发现HupA 在AD 治疗中的作用提供了一种新颖的方法。