基于顶空-固相微萃取-气相色谱-三重四极杆质谱联用的诃子挥发性成分分析

谭 鹏，周永峰，黄浩洲，朱 薇，包晓明，林俊芝，张定*，赵军宁

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

2.岛津企业管理（中国）有限公司，四川 成都 610023

3.成都中医药大学附属医院中心实验室，四川 成都 610072

4.四川省中医药科学院 国家中医药管理局中药质量生物评价重点研究室，四川 成都 610041

诃子Chebulae Fructus又叫诃黎勒，为使君子科植物诃子Terminalia chebulaRetz.或绒毛诃子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果实，味酸、涩，功能涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽，临床用于久泻久痢、肺虚喘咳、咽痛音哑等症[1]。诃子在藏成药中使用广泛，享有“藏药之王”的美誉[2]。现代研究表明，诃子具有抗氧化[3-5]、抗菌[6-7]、抗腹泻[8]、修复肝损伤[9-10]等多种药理作用，具有较高的药用开发价值。

诃子药材闻起来有一种“酸”的嗅觉，但诃子散发出的这种“酸”气中含有哪些化学成分，其“酸气”强度与其质量差异是否存在关联性等方面尚未见到相关研究报道。客观量化评价中药材的挥发性成分是一个难点，主要在于缺少一些高通量、准确、快速、实用的分析手段。顶空-固相微萃取（head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME）是一种样品前处理技术，集提取、富集、解吸和进样等步骤于一身，具有操作简便快速，灵敏度高，避免使用有机溶剂等特点。HS-SPME 技术适合分析易挥发性和半挥发性物质，它能全面快速地获得样品中挥发性物质的组成信息[11-12]。本研究尝试基于顶空-固相微萃取-气相色谱-三重四极杆质谱联用技术（HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS）建立一种诃子药材挥发性快速分析方法，辨识诃子“酸气”中的化学成分，探讨不同产地诃子之间的挥发性成分差异，以期从诃子挥发性成分分析的角度为诃子的质量差异评价提供客观数据支撑。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TQ8050 三重四极杆气质联用仪（Shimadzu，日本），配备PAL 加热磁力搅拌模块，数据分析软件配备 Off-flavor-TQ-MS 数据库；PAL SPME Arrow 固相微萃取进样器（1.5 mm×120 μm×20 mm，PN：ARR15-DVB/C-WR-120/20CT，CTC Analytics AG，Switzerland），PAL SPME Fiber 固相微萃取进样器（95 μm×10 mm，Carbon WR Fiber，PN： FIB-C-WR-95/10， CTC Analytics AG ，Switzerland），XPE26 电子天平（Mettler Toledo 公司，瑞典）。

1.2 试药

苯乙酮（2 μg/mL，批号48292，Sigma 公司）、萘（5 μg/mL，批号40053，Sigma 公司）、2,6-二氯苯酚（2 μg/mL，批号40302，Sigma 公司）、2,4,6-三氯苯甲醚（2 μg/mL，批号47526-U，Sigma 公司）4 种化合物用于评估系统适应性。4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4 的混合溶液（2 mg/mL，批号47358-U，Sigma-Aldrich 公司），苊-d10（2 mg/mL，批号48417，Sigma-Aldrich 公司）3 种化合物用作内标物。

1.3 药材

21 批次诃子药材来自于印度、印度尼西亚、越南、缅甸和中国云南省临沧市等地，样品均由成都市食品药品检验研究院文永盛主任中药师鉴定为诃子Terminalia chebulaRetz.。具体样品信息见表1。

表1 21 个诃子样品的采集信息Table 1 Details of 21 Chebulae Fructus samples

2 方法与结果

2.1 气相色谱条件

色谱柱为InertCap Pure-WAX 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度为250 ℃，分流进样，分流比为5∶1，进样口压力为83.5 kPa；载气为高纯氦气，载气控制方式为恒压力模式；吹扫流量为3.0 mL/min；程序升温：初始温度为50 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 升温至250 ℃，保持10 min；柱平衡时间为2.0 min。

2.2 质谱条件

离子源为电子轰击源（EI），离子化能量70 eV，离子源温度为200 ℃，质谱传输接口温度为250 ℃，碰撞气为氩气；质谱监测模式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），检测器电压相对于调谐结果＋0.3 kV，溶剂延迟时间为1.3 min。各化合物的监测离子对、碰撞电压（CE）见表2。为提高检测灵敏度，本实验采用时间分段监测各化合物。

2.3 顶空-固相微萃取条件

诃子样品碎粉成细粉（过三号筛），准确称取0.5 g，置于20 mL 惰性化顶空瓶内，50 ℃平衡40 min。进样前后，固相萃取头在270 ℃老化装置中自动老化3 min，通过聚四氟乙烯隔垫插入顶空瓶内，不接触样品，在50 ℃恒温下萃取吸附10 min 后，抽出萃取头，迅速插入在预运行状态下的GC-MS 进样口，于250 ℃状态下解吸2 min 后，进行GC-MS/MS 分析。

表2 153 个化合物（包含3 个内标物）的监测离子对、碰撞电压参数Table 2 Monitoring ion pairs and collision voltage parameters of 153 compounds

续表2

续表2

2.4 供试品定性定量方法

先精密吸取苯乙酮、萘、2,6-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯甲醚等4 种化合物的混合对照溶液1 μL（在10 mL 量瓶中加入甲醇5 mL，用移液器精密吸取4 种化合物的对照品溶液各10 μL 加入量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得）进样分析，评估仪器系统的适用性。再精密吸取4-溴氟苯、1,2-二氯苯-d4、苊-d10 等3 种内标物的混合溶液1 μL（在10 mL 量瓶中加入甲醇5 mL，用移液器精密吸取4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4 的混合对照品溶液、苊-d10 对照品溶液各10 μL 加入量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，用移液器精密吸取此混合溶液50 μL 加入1 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm 微孔滤膜，即得）进样分析，获得内标物的峰面积。最后再按照上述条件测定样品。目标化合物的定性是根据定性定量离子对确认，目标化合物的定量是根据岛津TQ8050 再解析软件内150 种化合物的标准曲线结合内标物的实测峰面积来定量。

2.5 诃子挥发性成分定性分析

定性分析结果显示，从诃子药材中共筛查出86 种挥发性化合物，按化合物结构可分为11 类，包括酯类、酮类、醛类、烯类、酚类、酸类、醇类、苯类、醚类、吡嗪类、酰胺类等。典型的诃子18 号供试品MRM 监测总离子流图（TIC）见图1，结果见表3。

图1 典型的诃子18 号供试品MRM 监测TIC 图Fig.1 Typical total ion chromatogram of Chebulae Fructus sample yp18

表3 9 个代表性诃子样品中挥发性成分筛查与定量分析结果Table 3 Results of odor screening and quantitative analysis of nine Chebulae Fructus samples

续表3

2.6 诃子挥发性成分定量分析

利用内标法对诃子中筛查出的86 种挥发性化学成分进行定量分析，需要指出的是，由于缺少标准物质，本实验采用的是数据库里的标准曲线结合实测内标物质的峰面积进行定量分析，因此实验中对86 种化学成分的定量只是“半定量”。由于版面篇幅限制，表3 中列出了不同产地代表性诃子样品的定量测定结果。

2.7 不同产地的诃子挥发性成分主成分分析（principal component analysis，PCA）

鉴于测定的样本量和挥发性成分较多，数据量较大，为了探讨能否通过挥发性成分来区分不同产地诃子，采用SIMCA-P 14.1 软件对不同产地诃子的86 种化学成分测定结果进行PCA。同时考虑到不同产地的诃子外观性状差异较大，以诃子的外观性状作为分组原则，以黄棕色且有棱的越南和中国临沧永德产诃子作为一组，以黑色且有深皱纹的缅甸和中国临沧永康产诃子为一组，以暗棕色且无皱纹的印度尼西亚和印度产诃子为1 组，将各组样品的86 种挥发性物质的含量测定结果导入软件分析。样本间的得分图显示，不同产地之间的诃子有一定的区分，但区分不明显，见图2。以越南和中国云南临沧产诃子为例，两者在外观性状上差异较小（仅有金黄色颜色深浅差异），2 个产区的诃子在PCA 分析过程中组间区分度较小，但与其它产区的诃子组间区分度较大。组间区分结果能够与产地分组基本吻合，这提示不同产地的诃子中挥发性成分可能存在地域特征差异，但仍需大样本量进一步验证。

图2 不同产地的诃子样品中86 种挥发性化学成分含量PCA 分析图Fig.2 Results of PCA of 86 volatile compounds in Chebulae Fructus samples from different regions

载荷散点图（图3）显示了不同挥发性化学成分对产地区分的贡献度大小，其中贡献度较大的化学成分或许可作为辨识不同产地诃子的特征性化合物。以贡献度最大的化学成分α-松油醇（63 号）为例，其在21 个样本中的质量分数平均值为0.40 pg/g，但在不同产地分组中的平均质量分数差异较大，分别为0.11（印度尼西亚＋印度）、0.62 pg/g（越南＋中国临沧永德）、0.25 pg/g（缅甸＋中国临沧永康）；箱式图显示了α-松油醇在各组含量分布的离散情况，表明其在缅甸、中国临沧永康产的诃子样本中含量分布差异较大，是影响产区识别的主要成分。实验中发现乙酸的含量明显高于其余85 个挥发性成分的含量，其在21个样本中的含量平均值为89.79 pg/g，但其对产区识别的贡献度并不大，箱式图显示其在样本间的含量分布差异大小为缅甸＋中国临沧永康＞印度尼西亚＋印度＞越南＋中国临沧永德，见图4。

图3 不同产地的诃子样品中86 种挥发性化学成分含量PCA 载荷散点图Fig.3 Loading scatter plot of PCA analysis of 86 volatile chemical compounds in Chebulae Fructus samples from different regions

图4 不同产地的诃子样品中α-松油醇和乙酸含量分布情况Fig.4 Content distribution of α-terpineol and acetic acid in Chebulae Fructussamples from different regions

3 讨论

实验中比较了SPME Arrow 和SPME Fiber 2种固相微萃取进样器对诃子中挥发性成分的萃取效率和检测灵敏度。和SPME Fibe 相比，SPME Arrow 样品萃取时间显著缩短，减少了转移过程中分析物的损失，使得检测灵敏度高于 SPME Fiber，因此最终优选SPME Arrow 作为本实验的固相微萃取进样器。诃子的化学成分主要有鞣质类[13-15]、三萜类[16-17]、黄酮类[18]等。有文献报道诃子药材中含有挥发性成分[19-20]，本研究进一步明确了诃子药材中至少有86 种挥发性成分，按化合物结构可分为酯、酮、醛、烯、酚、酸、醇、苯、醚、吡嗪、酰胺11 类，且主要为脂溶性成分，丰富了诃子药材的化学成分研究。诃子药材中含有大量乙酸、月桂酸等有机酸类成分，总体表现出“酸”的复合嗅气。不同产地之间的诃子中挥发性成分的种类基本一致，但在含量上存在一定差异，提示不同产地的诃子中挥发性成分的累积可能存在地域特征，但仍需用大样本量数据进一步验证。

本实验基于HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS 技术建立了一种诃子中150 种挥发性成分快速筛查和定量分析方法，具有高通量、快速、准确和简便的特点，对其它中药材的挥发性成分分析具有参考价值。

志谢：成都市荷花池中药材市场杨定明对样品收集做出的贡献，成都市食品药品检验研究院文永盛主任中药师和成都市三勒浆药业集团樊三虎高级工程师对样品鉴定做出贡献。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突