人参属植物高温蒸制前后人参皂苷含量的变化和细胞毒活性研究

顾承真，曾碧雪，张钰佳，王 东，张颖君*

1.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350001

2.中国科学院昆明植物研究所，植物化学与西部植物资源可持续利用国家重点实验室，云南 昆明 650201

人参属植物是最有价值的药用植物，人参Panax ginsengMeyer、三七P.notoginseng(Burk.) F.H.Chen 和西洋参P.quinquefoliumL.都是人参属植物中名贵的中药材。在两千多年前，人参属植物的根就被用来治疗和预防各种疾病[1]，其茎、叶、花和果实不但是重要的药用资源，还被用作功能性食品和化妆品[2]。人参和三七主要产于亚洲，西洋参主要产于北美，近些年在中国东北也有种植。人参属植物在高温蒸制前后药理活性不同，所以经常对其进行加工高温蒸制后使用。传统上人参根在使用的时候有白人参和红人参2 种形式，白人参是收获后直接晾干获得，红人参是经过加热处理后形成的[3-5]。三七和西洋参的根经常经过浸泡或蒸煮后使用。中药高温蒸制已经有数千年的历史，高温蒸制不但能使药材产生新的药理或治疗作用，还能够减少或消除中药的毒性或副作用。蒸煮、烘焙、焙炒、油炸、浸泡等都是常用的高温蒸制方法。

近些年从人参属植物不同部位分离得到的化合物有200 多个，包括人参皂苷、多糖、多肽和氨基酸等[6-8]。从高温蒸制的根、茎、叶和花等部位也分离得到一些转化的人参皂苷[2,9]。人参皂苷是人参属植物中最典型的活性成分[2]，根据人参皂苷的结构可将其分为2 大类，原人参二醇型和原人参三醇型。对人参、三七、西洋参及其高温蒸制品进行研究发现，不同人参属植物中典型的人参皂苷也不同[10-12]。比如，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和三七皂苷R1是三七根的主要成分，高温蒸制后三七根的主要成分转化为20(S/R)-人参皂苷Rg3、Rh1、Rk1、Rg5、Rk3和Rh4。不同人参属植物由于化学成分不同导致其具有不同的药理活性，比如抗癌、免疫调节、免疫抑制、抗过敏、抗动脉粥样硬化、降血压、预防糖尿病、抗病毒等[13-16]。目前，人参属植物在高温蒸制前后化学成分及其含量的变化缺少详细的阐述。

本课题组从事人参属植物研究已有二十多年，对其化学成分进行过系统的研究[9,16-22]。本实验采用HPLC 法对人参、三七、西洋参及其高温蒸制品、三七茎叶及其高温蒸制品中的人参皂苷进行了定性和定量分析，并测定了人参属植物及其高温蒸制品对人类4 株癌细胞（人类骨髓癌HL-60 细胞、肝癌SMMC-7721 细胞、肺癌A-549 细胞、乳腺癌SK-BR-3细胞）的细胞毒活性。

1 材料与仪器

人参Panax ginsengMeyer 和西洋参Panax quinquefoliumL.的干燥根于2013年4月购买于中国吉林，三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 整株样品于2013年3月购买于云南文山，并且分为根和茎叶2 部分。这3 种样品均由中国科学院昆明植物研究所张颖君研究员鉴定。

对照品人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rb3、Rh3、Rk2，三七皂苷Fc 和R1，绞股蓝皂苷IX，20(S/R)-三七皂苷Ft1，20(S/R)-三七皂苷Rg3、Rs3、Rh2，20(S)-人参皂苷Rh1，20(R)-人参皂苷Rh1为实验室从人参属植物中分离获得并用质谱和核磁共振波谱鉴定其结构，HPLC 测定这些皂苷的质量分 数 均 大 于 95% 。 人 参 皂 苷 Rb2（ 批 号M21D11S135160）、Rc（批号M27GB141849）购买于上海同田生物技术有限公司，质量分数均＞98%。水用的是 Milli-Q 过滤水（Millipore S.A.S.67120 Molsheim-France facility），色谱级乙腈购买Merck 公司（Darmstadt，德国），其他溶剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 有效成分测定

2.1.1 供试品溶液的制备 人参、西洋参、三七根和三七茎叶喷洒适量水后放置于高压灭菌锅中，在120 ℃条件下蒸12 h，再保持24 h，得到高温蒸制人参根、高温蒸制西洋参根、高温蒸制三七根和高温蒸制三七茎叶。取上述高温蒸制和未高温蒸制的样品各100 g 用70%甲醇水回流提取3 次，每次3 h。提取液浓缩除去有机溶剂，上D101 大孔吸附树脂柱，用水洗脱，直到用薄层色谱板监控流出液无任何物质为止，用90%乙醇洗脱得到各个样品的总皂苷，人参根总皂苷、高温蒸制人参根总皂苷、西洋参根总皂苷、高温蒸制西洋参根总皂苷、三七根总皂苷、高温蒸制三七根总皂苷、三七茎叶总皂苷、高温蒸制三七茎叶总皂苷。三七茎叶的70%提取物先用石油醚萃取后，再上D101 大孔吸附树脂柱。取样品各200 mg，样品F 100 mg，加甲醇定容至10 mL，得到供试品溶液，然后用0.45 μm 膜滤过，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备 准确称量22个对照品于5 mL量瓶中，用50%甲醇溶解、定容，得到各个质量浓度的对照品溶液，然后用0.45 μm膜滤过，得到含1.05 mg/mL人参皂苷Rg1、0.5 mg/mL人参皂苷Re、1.05 mg/mL 人参皂苷Rb1、0.9 mg/mL人参皂苷Rc、0.9 mg/mL人参皂苷Rb2、1.35 mg/mL人参皂苷Rd、0.55 mg/mL人参皂苷Rk3、0.9 mg/mL人参皂苷Rh4、1.0 mg/mL 20(S/R)-人参皂苷Rg3、1.75 mg/mL 20(S/R)-人参皂苷Rk1、0.6 mg/mL 20(S/R)-人参皂苷Rg5、0.524 mg/mL三七皂苷R1、0.95 mg/mL 20(S)-人参皂苷Rh1、1.0 mg/mL 20(R)-人参皂苷Rh1、5.25 mg/mL 三七皂苷Fc、0.95 mg/mL 人参皂苷Rb3、1.05 mg/mL绞股蓝皂苷IX、1.0 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Ft1、2.3 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Rs3、1.0 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Rh2、0.375 mg/ mL 20(S/R)-三七皂苷Rh3、0.95 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Rk2的混合对照品溶液。

2.1.3 色谱条件 高效液相色谱配备PAD 检测器；色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm)；体积流量1.0 mL/min；进样体积 10 μL；柱温25 ℃；检测波长203 nm；流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：0～20 min，20%～22% A；20～45 min，22%～46% A；45～55 min，46%～55% A；55～75 min，55% A，75～90 min，55%～90% A。

2.1.4 线性关系考察 将每个对照品溶液按不同体积（2、5、10、20、40、80、100 μL）进高效液相色谱分析，然后以峰面积为纵坐标（Y）、进样量为横坐标（X）制成每个对照品的标准曲线及线性回归方程，这22 个化合物的线性回归方程见表1。

表1 化合物的线性方程Table 1 Linearity, correlation coefficient of compounds

2.1.5 精密度试验 取照品混合液，连续进样6 次，测定这22 种皂苷色谱峰的峰面积。人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rb3、Rh3、Rk2，20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、三七皂苷Fc、三七皂苷R1、绞股蓝皂苷IX、20(S/R)-三七皂苷Ft1、20(S/R)-人参皂苷Rg3、人参皂苷Rs3、人参皂苷Rh2峰面积的RSD 值分别为0.86%、0.82%、0.57%、0.93%、0.54%、0.66%、0.96%、0.77%、0.69%、0.39%、0.89%、0.91%、1.02%、0.95%、1.04%、0.61%、0.52%、0.46%、0.77%、0.73%、0.69%、0.81%。

2.1.6 稳定性试验 取人参样品分别在配制好后1、4、8、16、32、48 h 进样测定，计算人参样品中6 个主要成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的RSD值分别为0.68%、0.99%、1.21%、1.32%、1.02%、0.98%。

2.1.7 重复性试验 称取人参样品100 g，共6 份。按照供试品溶液制备方法，测定人参样品中6 个主要成分的含量。人参中6 个主要成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的RSD 值分别为1.97%、1.99%、1.58%、1.87%、2.02%、2.13%。

2.1.8 加样回收试验 称取人参样品100 g，共6 份。分别加入与样品中6 个主要成分含量相当的对照品溶液，按照供试品制备方法制备成加样供试品溶液。测定6 个主要成分的含量，计算加样回收率。人参中6个主要成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的加样回收率分别为97.81%、98.79%、102.31%、101.36%、100.35%、103.12%，RSD 值分别为1.32%、1.15%、1.21%、1.01%、0.96%、1.19%。

2.1.9 人参皂苷含量测定 用“2.1.3”项色谱条件测定按照“2.1.1”项得到的样品人参根总皂苷、高温蒸制人参根总皂苷、西洋参根总皂苷、高温蒸制西洋参根总皂苷、三七根总皂苷、高温蒸制三七根总皂苷、三七茎叶总皂苷和高温蒸制三七茎叶总皂苷中22 种皂苷的含量。每个样品重复进样3 次，取平均峰面积根据线性方程计算皂苷的含量。

2.2 人参皂苷含量测定结果

人参、西洋参、三七和三七茎叶及其高温蒸制品的HPLC 谱图见图1，通过紫外吸收和保留时间跟对照品比对，共鉴定出22 个皂苷类化合物，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rb3、Rh3、Rk2、20(S)-人参皂苷Rh1、20(R)-人参皂苷Rh1、三七皂苷Fc、三七皂苷R1、绞股蓝皂苷IX、20(S/R)-三七皂苷Ft1、20(S/R)-人参皂苷Rg3、Rs3和Rh2。这些化合物在人参、西洋参、三七和三七茎叶及其高温蒸制品中的含量见表2。

图1 人参属植物及其高温蒸制品的色谱图Fig.1 Chromatograms of samples from ginsengs and their steaming processed products

表2 人参属植物及其高温蒸制品中人参皂苷含量Table 2 Contents of saponins in eight ginseng samples

结果显示，原人参二醇型和原人参三醇型人参皂苷是人参、三七和西洋参的主要成分，但在三七的茎叶中只检测到原人参二醇型人参皂苷。人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd 为人参的主要成分；人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd 为西洋参的主要成分；人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和三七皂苷R1为三七的主要成分；三七皂苷Fc、人参皂苷Rb3和绞股蓝皂苷IX 为三七茎叶的主要成分。人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd 是人参属植物原材料中最常见的人参皂苷，但在不同的人参属植物中，其含量也不同。人参皂苷Rg1和人参皂苷Rd 的含量，三七＞人参＞西洋参；人参皂苷Re 的含量，西洋参＞人参＞三七；人参皂苷Rb1的含量，西洋参＞三七＞人参。三七皂苷R1是三七特有的皂苷，在其他2 种人参属植物中没有检测到。人参皂苷Rc 和Rb2是人参中特有的成分。三七皂苷Fc，人参皂苷Rb3和绞股蓝皂苷IX 仅存在于三七茎叶中。

高温蒸制后，人参、三七和西洋参的主成分全部转化为人参皂苷Rk3、Rh4、Rk1、Rg5和20(S/R)-人参皂苷 Rg3。这5 个人参皂苷在高温蒸制三七中的总含量比在高温蒸制人参和高温蒸制西洋参中的含量高。20(S)-人参皂苷Rh1和20(R)-人参皂苷 Rh1仅在高温蒸制三七中检测到，在其他高温蒸制品中未检出。三七茎叶中的三七皂苷Fc，人参皂苷Rb3和绞股蓝皂苷 IX 经过高温蒸制后转化生成了20(S/R)-人参皂苷Rg3、人参皂苷Rk1、Rg5和20(S/R)-三七皂苷Ft1、人参皂苷Rs3、Rh2、Rh3和Rk2。

人参、西洋参、三七和三七茎叶主要皂苷在分子结构的C-3 位、C-6 位或者C-20 位连接2 个或者3 个不同类型的糖，高温蒸制过程中先发生脱糖反应，然后在C-20/21 位或者C-20/22 位发生脱水反应后得到高温蒸制人参、西洋参、三七和三七茎叶的主要皂苷成分。

2.3 细胞毒活性

测定人参、西洋参、三七和三七茎叶及其高温蒸制品对4 株人类癌细胞（HL-60、SMMC-7721、A-549、SK-BR-3）的细胞毒活性。采用MTT 法［ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenlytetrezolium bromide］（Sigma 公司，St.Louis，美国），通过96孔板测定上述8 个样品的细胞毒活性[23]。所有细胞都用DMEM 培养基（Hyclone，美国），添加10%胎牛血清，5% CO2、37 ℃条件下培养。将100 μL 的悬浮液添加到96 孔板中，再在96 孔板中加入不同浓度的供试品溶液，培养48 h 后，在每孔中添加20 μL MTT溶液（5 mg/mL PBS），继续培养4 h得到formazan晶体。除去上清液后加入100 μL 20%的十二烷基磺酸钠（SDS），培养过夜直到formazan 晶体完全溶解。用酶标仪在595 nm 条件下测定吸光度，半数抑制浓度（IC50）值计算采用Reed 和Muench 方法。

细胞毒测定结果显示，人参、高温蒸制人参、西洋参、高温蒸制西洋参、三七和三七茎叶在100 μg/mL 的质量浓度下对4 株人类癌细胞（图2）显示出微弱的抑制活性。高温蒸制三七茎叶和高温蒸制三七对A-549 和HL-60 显示出很强的抑制活性，IC50分别为43.3、33.8 μg/mL（A549），21.6、40.0 μg/mL（HL-60），阳性对照顺铂的IC50为6.7 μg/mL（A549）和0.4 μg/mL（HL-60）。高温蒸制三七的细胞毒活性比高温蒸制人参、高温蒸制西洋参和三七强，说明高温蒸制后三七的细胞毒活性增强。高温蒸制三七具有较强的细胞毒活性与其化学成分息息相关，20(S)-人参皂苷Rh1和20(R)-人参皂苷Rh1只存在于高温蒸制三七中，并且20(S/R)-人参皂苷Rg3在高温蒸制三七中的含量比在其他样品中的含量高。前期有研究报道人参皂苷Rg3和Rh1具有一定的细胞毒活性，导致高温蒸制三七细胞毒活性比其他样品强[24-25]。

图2 人参属植物及其高温蒸制品的细胞毒活性Fig.2 Cytotoxic activities of samples from ginsengs and their processed products

3 讨论

对人参、西洋参、三七和三七茎叶及其高温蒸制品中的人参皂苷进行了定性和定量分析。经过高温蒸制原材料中的主要成分完全消失，转化为另外5 个主成分[人参皂苷Rk3、Rh4、Rk1、Rg5和20(S/R)-人参皂苷Rg3]。三七的细胞毒活性比人参和西洋参强，高温蒸制三七的细胞毒活性又强于三七，说明高温蒸制后三七的细胞毒活性增强，这也符合中药高温蒸制的目的。研究结果为人参、西洋参和三七的研究和应用提供了基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突