红花PAL家族全基因组分析及其在悬浮细胞中的表达

郭英男，刘月扬，马静雨，张 敬，马鑫彤，张馨月，刘建雨，姚 娜，刘秀明，李海燕

吉林农业大学生命科学学院，生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，吉林 长春 130118

红花Carthamus tinctoriusL.为菊科红花的干燥管状花。辛、温，归心、肝经。气微香，味微苦。具有活血通经、散瘀止痛功效。主治经闭、痛经、胸痹心痛、跌扑损伤和疮疡肿痛等[1]。《本草纲目》记载红花汁与血同类，“故能行男子血脉，通女子经水。多则行血，少则养血”[2]。现代药理、临床研究证明，红花具有扩张血管、抗凝血、抗血栓、抗炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管、保护神经、降压和增强免疫等活性[3-6]。红花花瓣最主要的活性化学成分是黄酮类化合物，主要分为黄酮类、黄酮醇类、醌式查耳酮类和二氢黄酮类。醌式查耳酮类的红花黄色素（SY）占1/5～1/3[5-6]，是红花的主要有效成分，有抗心肌缺血、扩张冠状动脉、抑制血小板凝聚、促进血液循环、抗氧化、抗炎等药理作用[7-9]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia- lyase，PAL）将苯丙氨酸脱氨转化成反式肉桂酸，该反应是红花黄酮类生物合成途径的起始反应，苯丙烷类合成代谢的关键酶。PAL 在植物发育过程中起作用，对苯基丙烷次生代谢产物进行调控，对多种环境刺激产生响应[10-13]。PAL 通常是由小的多基因家族编码[12]，PAL基因家族常含有的2～6 个家族成员（PAL1、PAL2 和PAL3 等）在植物中的表达具有组织特异性[13]，其相对分子质量在220 000～340 000，是一种由4 个77 000～83 000 亚基构成的寡聚酶[14-15]。PAL受内部钝化因子、调节因子和末端产物的调控，是一种诱导酶，当植物在受到病原体攻击、机械损伤、紫外线照射、盐分胁迫、植物激素（乙烯等）和光等刺激后，快速在转录水平上诱导PAL 编码基因的表达[16]。

利用真核或原核微生物研究一个简单的次生代谢产物的生物合成，至少需转入多个植物外源基因才能实现[17]。并且利用原核微生物表达植物蛋白酶，尚存在缺乏辅助因子、蛋白折叠错误、宿主膜的插入和产生包涵体等问题[18-19]。因此，与微生物相比，植物细胞含有次生代谢产物合成和储存的全部遗传信息。红花植株的生长周期为1～2年，故在整株植物水平上进行遗传操作较困难，而组织培养产生再生植株则容易存在生根困难和再生率低等问题[20-21]，这极大地限制了红花功能基因研究和红花黄酮生物合成研究的进程。未分化的植物愈伤组织在受控的液体培养基中进行不断搅动或摇动，可产生悬浮细胞。悬浮细胞具有增殖迅速、遗传背景清晰、分散性好、可体外操作且易控制[20-22]的优点，成为研究植物次生代谢产物及合成生物学必不可少的工具，可以作为体外大量合成植物次生代谢产物的良好生物反应器[22]。

因此，建立转基因红花悬浮细胞遗传体系，对进一步深入研究黄酮合成代谢调控具有重要的意义。目前，已有相关研究利用悬浮细胞，在基因和细胞水平上进行克隆表达，如利用烟草[23]、白桦[24]、雷公藤[25-27]、绿竹[28]、甘草[29]、苹果[30]悬浮细胞，研究其功能基因在生长发育、次生代谢和环境适应中的作用[31]。但是，通过红花悬浮细胞研究苯丙烷类次生代谢关键酶基因的相关研究，尚无报道。本研究在红花基因组测序基础上，对红花PAL家族进行全基因组分析，并建立了红花悬浮细胞遗传转化体系，成功构建了对红花PAL4（CtPAL4）基因表达载体，并初步在悬浮细胞中进行表达，一方面，为研究红花PAL基因的功能，探讨其在红花黄酮次生代谢途径中的作用奠定基础；另一方面，为红花悬浮细胞在功能基因、次生代谢调控及生物反应器等方面的研究提供理论依据。

1 材料与试剂

1.1 材料

样品经笔者鉴定为红花Carthamus tinctoriusL.吉红一号，于吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程中心基地种植，于盛花期采集花瓣，锡箔纸包好液氮处理后，保存于-80 ℃冰箱备用。pCAMBIA 3301 植物表达载体由本实验室保存。

1.2 试剂

RNA 提取试剂盒，购自北京百泰克生物技术有限公司；反转录酶，购自Clontech 公司；LA Taq 酶等购自宝日医生物技术（北京）有限公司；BglII、BstE II 等内切酶，购自Thermo Scientific 公司；pEASY-T1 Simple Cloning Kit（CT111-01），购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自爱思进生物技术有限公司；T4 连接酶购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

MS 基础培养基（蔗糖20 g/L、MS 粉4.33 g/L、肌醇0.1 g/L、有机营养液3.4 mg/L 和琼脂粉8 g/L），有机营养液配方（甘氨酸0.4 g/L、烟酸0.1 g/L、盐酸吡哆素0.1 g/L 和盐酸硫酸素0.08 g/L）；愈伤诱导培养基（MS 基础培养基、NAA 2 mg/L 和6-BA 0.5 mg/L）；继代培养基（MS 基础培养基、NAA 1 mg/L和6-BA 0.5 mg/L）；悬浮细胞液体培养基（不加琼脂粉的MS基础培养基、NAA 1 mg/L和6-BA 0.5 mg/L）；YEP 培养基（酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L 和氯化钠5 g/L，如需固体YEP 则添加琼脂粉8 g/L）；LB 培养基（蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L 和酵母粉5 g/L）。

2 方法

2.1 红花PAL 家族全基因组分析

从Pfam 数据库下载PAL 蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型文件（PF00221），以PF00221 为探针，利用HMMER3.0 软件在红花基因组中检索具有该结构域的基因。利用DNAMAN软件进行多序列比对分析，NCBI 的CDD（conserved domain database）数据库对蛋白质序列的功能结构域进行分析预测。提取转录起始点上游2000～200 bp 序列，利用plantCARE 在线分析启动子上游区域顺式作用元件，并用TBtools 实现重要顺式作用元件的可视化分析。利用CLSTAL X1.81 和MEGA 5.2 进行多重序列比对分析和聚类分析，构建红花PAL 家族的系统发育进化树。

2.2 红花总RNA 提取及cDNA 合成

红花（吉红一号）盛花期花瓣总RNA 提取使用RNA 提取试剂盒（BioTeke 公司），按说明书进行操作，然后用反转录酶合成cDNA 第1 链，反转录cDNA 作为CtPAL4基因克隆模板。

2.3 CtPAL4 基因的克隆

根据红花基因组测序结果，获得红花PAL基因的多条候选序列，将候选序列与NCBI 数据库其他植物进行同源性比对，将同源性高的序列（CtPAL4）作为候选基因进行克隆，基因的特异性引物序列为5’-ATGGATCAATACATGAGCAATGTTATGAAGA- AATAGGAAGTGG-3’。

以红花花瓣cDNA 为模板进行编码区序列的扩增，首先进行温度梯度PCR，获得最佳退火温度。PCR反应体系：cDNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，10×LA Buffer 5 μL，上游引物CtPAL4f（10 µmol/L） 1 μL，下游引物CtPAL4r（10 µmol/L） 1 μL，LA Taq 0.5 μL，水33.5 μL，总体积50 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循环；72 ℃延伸10 min。凝胶电泳检验是否获得目的条带。扩增产物凝胶回收后连接T 载体进行测序。

2.4 CtPAL4 基因的生物信息学分析

利用WOLF PSORT 进行亚细胞定位分析，分别利用EXPASY-SOPMA 软件和EXPASY-phyre2 进行蛋白质二级结构和三级结构分析。利用DNAMAN 软件进行多序列比对分析，用Conserved Domains Search（InterProScan）预测蛋白质序列的功能结构域，利用CLSTAL X1.81 进行系统进化树分析。利用Tmpred 预测蛋白的跨膜结构，利用ProtFun202 进行功能预测， ProtParam 软件（http://web.expasy.org/）分析编码蛋白的氨基酸序列的组成、相对分子质量和等电点等理化性质。

2.5 CtPAL4 基因植物表达载体的构建

以pCAMBIA 3301（图1）作为植物表达载体骨架，将测序正确的CtPAL4两端分别引入酶切位点BglII 和BstE II，替换载体上的β-葡聚糖苷酶报告基因（GUS），构建植物表达载体。以获得的CtPAL4基因T 载体为模板，进行PCR 扩增，扩增产物凝胶回收后连接T 载体进行测序。对连有酶切位点的CtPAL4基因的T 载体和pCAMBIA 3301 载体分别进行双酶切，建立200 μL 酶切体系，经过4 h 酶切后，获得的酶切产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒切胶回收CtPAL4目的基因片段和pCAMBIA 3301 载体。将获得的CtPAL4目的基因片段和pCAMBIA 3301 载体用T4 DNA Ligase 酶连接过夜。连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1 感受态细胞，过夜培养。次日，挑取白斑至10 mL LB 液体培养基的试管中，200 r/min，37 ℃，培养8 h。提取质粒进行PCR 和酶切鉴定，酶切鉴定正确的菌液进行测序。

图1 pCAMBIA3301 表达载体结构示意图Fig.1 Structure of pCAMBIA3301 expression vector

2.6 工程农杆菌的转化

验证正确的质粒1 μL，加入到EHA105 农杆菌感受态细胞中，冰浴30 min。液氮冷冻5 min，37 ℃水浴，热击5 min。在离心管中加入1 mL 不加抗生素的YEP 液体培养基，混匀后放于摇床中，28 ℃，200 r/min 振荡4 h。5000 r/min 离心6 min。离心后加入200 mL YEP 液体培养基进行重悬。取重悬后的菌体涂在含有10 mg/L 利福平的YEP 固体培养基中，28 ℃培养2～3 d。待长出菌落后，挑取单菌落，于10 mg/L 利福平的YEP 液体培养基的试管中， 过夜培养后进行菌液PCR 验证，将验证正确的菌液加入甘油，-80 ℃冰箱保存备用。

2.7 红花悬浮细胞遗传体系的建立

利用实验室已建立的体系获得红花悬浮细胞[19]，将红花种子接种到MS 基础培养基中培养出无菌苗；无菌苗子叶外植体接种到愈伤诱导培养基中，进行诱导；诱导出的愈伤组织接种到继代培养基中培养4～5 代。挑选质地疏松、不透明且淡黄色的愈伤组织[32]用于遗传转化。按照设计的实验组别进行遗传转化实验，每个组别进行3 次平行实验。三角瓶开口放一漏斗，漏斗上覆盖空气滤膜。三角瓶放于真空干燥罐内真空处理，调节空气压力至10、20、30 kPa，分别在15、10、7 min 内缓慢地释放压力，完成侵染过程。过滤除去液体培养基，滤纸吸收多余工程农杆菌，洗菌后转移至选择培养基上暗培养3 或4 天。使用羧苄（0、75 mg/L），头孢（100 mg/L）和草甘膦（0.50、0.75、1.00、1.25 mg/L）对遗传转化后的愈伤组织进行压力筛选，每个组别进行3 次平行实验。

对获得的愈伤组织进行GUS组织化学分析[34]。利用含有GUS基因pCAMBIA3301 的转化农杆菌，侵染红花愈伤组织，在转化后15 d，进行GUS 染色，将红花愈伤组织浸泡在含有1 mmol/L X-Gluc [溶于0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）和30% Triton X-100] 的GUS 染色液中，37 ℃暗培养过夜。分析前，用95%乙醇脱色除去叶绿素。在Olympus显微镜下，观察转基因愈伤组织中GUS基因瞬间表达产物（β-葡聚糖苷酶）对底物的水解情况。

2.8 转CtPAL4 基因红花悬浮细胞的PCR 鉴定

选取质地疏松且分散性好的胚性愈伤组织接种到悬浮细胞液体培养基中，25 ℃培养，避光摇床转速为100 r/min，获得红花悬浮细胞。吸取连续继代3代的转基因红花悬浮细胞，经孔径100 目镍网过滤，过滤物0.5 g 提取基因组，用于PCR 扩增。PCR 反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循环；72 ℃延伸10 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物。

3 结果与分析

3.1 红花PAL 家族全基因组分析

在红花基因组测序结果中，共注释到红花PAL家族6 个基因。利用NCBI 的CDD 数据库预测蛋白质序列的功能结构域。结果显示，5 个（CtPAL1～5）红花PAL 基因均具有PAL 家族的典型结构域（MIO结构域）及活性位点（图2-A），且含有PAL 酶家族的保守序列（GTITASGDLVPLSYIAG）。使用plantCARE 在线分析顺式作用元件，并用TBtools 对红花PAL家族基因启动子中选定的9个重要顺式作用元件进行可视化分析（图2-B）。启动子区域包含多个典型启动子核心调控元件、激素响应元件和植物逆境胁迫响应元件。9 个顺式作用元件分别为茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-Motif）、防御及胁迫响应元件（TC-rich）、分生组织表达元件（CAT-box）、光响应元件（G-box）、光响应元件（MRE）、MYBHv1 结合位点（CCAAT-box）、MBSI（类黄酮合成相关的MYB转录因子结合位点）、AAGAA-motif。

利用DNAMAN 软件将6 个红花PAL家族基因与大麦、拟南芥和水稻等的基因进行同源性比较分析，并利用软件MEGA 5.2 邻接法聚类分析构建系统发育树（图3）。结果表明：80 个PAL序列明显聚成5 个分支，6 个红花PAL 家族基因单独聚在一个进化枝，同时与拟南芥（AT3G53260.1，AT2G37040.1）聚集在相同的分支，说明红花与拟南芥PAL基因家族的亲缘关系较近。其中，CtPAL4单独聚在一个分支上，说明在红花植株中CtPAL4可能与其他PAL基因行使不同的功能。因此，本研究将CtPAL4基因作为后续研究对象。

图3 红花PAL 家族基因的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree of Carthami Flos PAL family genes

3.2 红花总RNA 的提取

选择红花花瓣作为材料，提取总RNA。提取后的RNA 使用Nanodrop2000 进行RNA 浓度检测，其浓度为1368 µg/µL，A260/A280的比值为1.92，A260/230的比值为1.94。由此可见提取的RNA 样品纯度较高。琼脂糖凝胶电泳结果中28 S、18 S、5 S条带清晰可见，无明显拖尾现象（图4），说明所获得RNA 样品完整性较好。综上，所提取的红花总RNA 纯度较高、完整性较好，可用于反转录获得cDNA 实验。

图4 红花花瓣 (A) 及RNA 提取 (B) 电泳结果Fig.4 Total RNA agarose gel electrophoresis and petals from Carthami Flos

3.3 CtPAL4 基因的克隆

根据基因组中获得的CtPAL4基因编码区序列，以反转录的红花花瓣cDNA 为模板，首先进行温度梯度PCR 验证（图5-A），利用CtPAL4f 和CtPAL4r特异性引物进行PCR 扩增，结果显示，退火温度58 ℃时，在2000～4000 bp 位置扩增出目的片段，条带较亮且特异，说明设计的该对引物特异性良好。将目的基因片段胶回收后与T1 连接并转化大肠杆菌，菌液PCR 电泳验证（图5-B）有目的条带出现，对含有目的条带的大肠杆菌提取质粒，用BamHI和EcroI酶过夜双酶切。产物电泳检测（图5-C），将鉴定正确的菌液送苏州金唯智公司测序，测序结果获得2124 bp 的目的序列，测序结果与原序列吻合，因此将其命名为CtPAL4。

图5 CtPAL4 基因编码区克隆Fig.5 Cloning of coding sequence for CtPAL4 gene

3.4 CtPAL4 基因的生物信息学分析

将测序正确的CtPAL4基因序列进行生物信息学分析。序列分析表明，CtPAL4基因的开放阅读框（ORF）为2124 bp，编码707 个氨基酸（图6-A），相对分子质量为76 820，蛋白的三维结构如图6-B所示，与苯丙氨酸解氨酶X 射线蛋白质晶体结构类似。用Conserved Domains Search（InterProScan）预测蛋白质序列的功能结构域结果显示，CtPAL4基因具有典型的苯丙氨酸解氨酶基因的功能结构域及活性位点（图6-C）。基于蛋白质数据库，应用WOLF PSORT 在线分析软件，对CtPAL4基因编码蛋白进行亚细胞定位分析，推测其在细胞中的位置，结果显示，其可能定位在叶绿体和细胞质中，与PAL 定位于细胞质和一些细胞器（叶绿体、线粒体、过氧化酶体）相吻合。

图6 CtPAL4 基因编码氨基酸组成及蛋白结构分析Fig.6 Amino acids and protein structure of CtPAL4 gene

3.5 CtPAL4 基因的系统进化分析

利用DNAMAN 软件将CtPAL4基因与其他物种的基因进行系统发育进化分析。利用clustalW1.83软件进行多重序列比对、聚类分析，并构建系统发育树。 结果显示，CtPAL4基因与拟南芥（AY303130.1）的PAL基因聚在相同的分支，说明从进化上看，红花CtPAL4和拟南芥PAL 基因亲缘关系最近（图7）。

图7 CtPAL4 基因的系统发育进化树Fig.7 Analysis of evolutionary of CtPAL4 gene and others

3.6 CtPAL4 基因的植物表达载体构建

将前期验证成功的CtPAL4基因，在其引物两端引入BglII 和BstE II，进行PCR 扩增，获得带有含BglII 和BstE II 双酶切位点的CtPAL4基因，将其连接T 载体后命名为pEASY-T1-CtPAL4。将植物表达载体 pCAMBIA3301 和pEASY-T1-CtPAL4分别用BglII 和BstE II 进行双酶切，目的片段与酶切后的pCAMBIA3301 载体用T4-DNA 连接酶连接后，得到植物表达载体pCAMBIA3301-CtPAL4。将构建好的植物表达载体转化大肠杆菌DH5α，对重组阳性质粒进行菌液PCR 验证（图8-A）和双酶切验证（图8-B），都获得预期大小为2124 bp 的目的片段，测序结果与预期相符，证明植物表达载体构建成功。将酶切测序正确的植物表达载体pCAMBIA3301-CtPAL4质粒，利用冻融法转化农杆菌感受态EHA105，转化后涂板，对挑取的9 个单菌落进行农杆菌菌液PCR 鉴定（图8-C），其中有2条非常亮的目的条带出现，说明农杆菌转化成功，可以用于下一步的遗传转化。

图8 CtPAL4 基因植物表达载体构建Fig.8 Construction of plant expression vector of CtPAL4

3.7 红花悬浮细胞遗传体系的建立

对红花种子暗培养而成的无菌苗子叶进行愈伤诱导和继代培养，获得质地疏松、不透明且黄绿色的愈伤组织，作为遗传转化受体。农杆菌介导的遗传转化经过预培养、侵染、共培养、抑菌培养、pBaster 筛选和继代培养后获得转基因红花愈伤组织。获得的愈伤组织经过液体培养，形成均一的转基因红花悬浮细胞。

结果表明，当真空压力超过20 kPa 时，愈伤组织细胞容易发生破碎；当重悬液A600高于0.5 时，农杆菌难以被抑制，愈伤组织生长缓慢易褐化；共培养时间可延长至4 d。实验得出较优的遗传转化条件组合：重悬液A600＝0.5、10 kPa、侵染15 min 并共培养4 d。

结果表明，在75 mg/L 羧苄、100 mg/L 头孢和1.0 mg/L 草甘膦压力下，起到了一定的筛选作用。未经转化的愈伤组织几乎全部褐化死亡，而遗传转化的愈伤组织因为具有筛选标记基因可以正常生长且长势良好。

对转GUS基因愈伤组织进行组织化学染色，如图9 所示，显微镜下观察GUS转基因细胞为蓝色，而非GUS转基因则为棕绿色，说明外源基因已经成功转入到愈伤组织中。

图9 转基因愈伤组织GUS 染色验证Fig.9 GUS staining of transgenic callus

同时，将愈伤组织置于液体培养基中，避光摇床25 ℃、100 r/min 培养7 d，滤出愈伤组织，滤纸吸干表面水分。将细胞培养物置于60 ℃烘箱中烘3 h，计算细胞增长率为190.7%。

3.8 转CtPAL4 基因悬浮细胞的分子鉴定

经过压力筛选去除掉未经转化的愈伤组织，遗传转化的愈伤组织形成的转CtPAL4基因悬浮细胞，继代培养3 次后，提取转基因愈伤组织的基因组DNA，利用PAL 特异引物CtPAL4r 和CtPAL4f 进行PCR 鉴定。电泳结果如图10 所示，目的基因条带与CtPAL4基因大小一致，为2124 bp。因此，说明CtPAL4基因初步在红花悬浮细胞中实现过表达。

图10 转CtPAL4 基因悬浮细胞的分子鉴定Fig.10 Molecular identification of transgenic callus

4 讨论

PAL（EC 4.3.1.5）通常是由小的多基因家族编码[12]，在不同的植物物种中，PAL 基因家族的数量差异很大，从2 个到12 个不等，甚至达到40～50个[34]。在大多数高等植物中，PAL 是由2～6 个基因家族构成的小基因家族编码的[35]。通过对红花PAL基因家族进行生物信息学分析，在红花基因组中共检索到6 个含有PAL 特有结构域的红花PAL家族基因，说明红花有6 个PAL基因家族成员，与其他大多数植物PAL基因家族成员个数相似，基本不含冗杂和未被利用的PAL。PAL 为同源四聚体，每个单体含有1 个MIO 结构域。MIO 结构域是PAL酶催化的辅因子，MIO 结构域含有PAL 酶家族的保守序列（GTITASGDLVPLSYIAG）和三联体活性中心（Ala-Ser-Gly）[36]。MIO 结构域三联体活性中心作为辅酶增强PAL 活性，通过攻击苯丙氨酸的芳香环，而增加苯丙氨酸的亲电性，来实现催化苯丙氨酸生成肉桂酸[37]，红花中的CtPAL1～5基因家族成员均含有MIO 结构域，均可以催化苯丙氨酸生成肉桂酸。CtPAL6不具有MIO 结构域，在红花中可能行使不同的生理功能，也可能属于冗杂或未被利用的PAL。

农杆菌介导的遗传转化已经被广泛应用于多种植物物种，目前，番茄、甜椒、马铃薯、油桐、烟草和橡胶树等多种植物的遗传转化日趋完善[38-40]。但是，通过农杆菌介导的红花愈伤组织CtPAL4基因遗传转化研究尚少，尚未建立一个有效完整的方案。本研究应用农杆菌介导的遗传转化，成功将红花黄酮代谢中关键酶PAL基因转化入红花愈伤组织，并形成红花悬浮细胞。红花种子暗培养而成的无菌苗子叶外植体，诱导形成的愈伤组织对农杆菌侵染有敏感性，且耐侵染、抑菌性强、恢复力强，符合作为遗传转化的受体条件[41]，红花种子经过5 d 的种子萌发、12 d 的植物激素（萘乙酸和6-苄基氨基喋呤）诱导愈伤和愈伤继代培养，获得质地疏松、不透明且黄绿色的愈伤组织，可以作为根瘤农杆菌遗传转化的受体。农杆菌介导的遗传转化需要经过预培养、侵染、共培养、抑菌培养、pBaster筛选和继代培养，才能获得转基因红花愈伤组织。目前的研究结果表明，农杆菌介导红花遗传转化效率取决于红花的基因型、苗龄、共培养时间、细菌细胞密度、AS 浓度和外植体类型等多种因素[33]。本实验建立的遗传转化方案较优，转化效率较高。

PAL 是目前研究最广泛的植物次生代谢酶之一。PAL 因其在植物发育中的作用，对植物类苯基丙烷次生代谢产物的调控，对多种环境刺激的响应而被广泛研究。PAL 催化的转氨反应，是红花黄酮类生物合成途径的起始反应，其表达水平与木脂素、黄酮类、香豆素和植物抗毒素的合成和积累密切相关[42-44]。PAL 又是一种诱导酶，当植物在受到病原体攻击、机械损伤、紫外线照射、盐分胁迫、植物激素（乙烯等）和光等刺激后，快速在转录水平上诱导PAL 编码基因的表达[12-14,16]。本研究通过生物信息学分析红花PAL 基因家族启动子上游顺式作用元件，发现红花具有茉莉酸甲酯响应元件、防御及胁迫响应元件、光响应元件和类黄酮合成相关的 MYB 转录因子结合位点等顺式作用元件。可见当红花受到环境刺激，相应的顺式作用元件在转录水平进行调控[45]，从而影响PAL 的转录表达。

转基因悬浮细胞培养被应用于细胞和分子生物学的基础研究（如功能基因的研究）和合成生物学方面（如药用蛋白的生产）。在这2 种情况下，外源基因或内源基因的转移和稳定整合都是必需的技术[46]。目前，王立勇等[19]实现人源CD20 片段抗体在红花悬浮细胞中的外源基因表达；刘金娜等[47]实现番茄Bax inhibitor-1 基因在烟草悬浮细胞中的外源基因表达；在研究雷公藤、绿竹、甘草等植物生长代谢相关基因功能时，悬浮细胞同源基因的转化与表达也得以实现[25-26,28-29,46]。本研究转CtPAL4基因红花悬浮细胞在经过3 次继代培养后，PCR 鉴定仍有目的基因出现，说明CtPAL4基因已经初步在红花悬浮细胞中实现过表达，为后续利用转基因红花悬浮细胞鉴定外源基因提供理论依据。为研究CtPAL4等合成代谢关键酶基因在次生代谢产物中的功能和作用、红花悬浮细胞产业化生物合成黄酮类次生代谢产物，奠定理论和实践基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突