槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞大鼠脑细胞的作用及机制研究

薛玉梅，李献军，孟 岩，宋 哲，刘惠钦，李晓兵*

1.石家庄市人民医院 神经内科，河北 石家庄 050027

2.石家庄市人民医院 药学部，河北 石家庄 050027

脑梗死是临床中常见的脑血管疾病，组织缺血缺氧导致坏死或软化，严重危害人类的生命。细胞凋亡是脑梗死引起神经损伤的重要机制之一，缺血缺氧下凋亡相关信号通路激活，引起神经细胞凋亡，脑梗死灶体积和神经功能缺损严重程度与细胞凋亡程度呈正相关[1]。槐定碱是从豆科槐属植物苦豆子Sophora alopecuroidesL.中提取分离的单体生物碱，具有抑制炎性因子分泌、抗氧化、抗癌、保护心脑血管等作用[2-3]。槐定碱能够通过下调肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptorassociated factor6，TRAF6）、上调磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）表达，从而减轻大鼠脑损伤和脑水肿程度[4]。本课题组前期研究表明，槐定碱能够抑制氧化应激和炎性反应，对局灶性脑缺血大鼠具有神经保护作用[5]。本研究探究槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）大鼠脑细胞凋亡的影响，为槐定碱的临床应用提供依据。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD 大鼠70 只，雌雄各半，8 周龄，体质量240～275 g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（宁）20100001。动物于温度（24±1）℃、湿度50%～70%的环境中适应性饲养1 周，自由进食饮水。动物实验经石家庄市人民医院伦理委员会批准（批准号2016017）。

1.2 药品与试剂

槐定碱（质量分数＞98%，批号960324）购自宁夏药物研究所；BCA 蛋白定量试剂盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（批号T8170）购自北京索莱宝科技有限公司；兔源B 淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体（批号sc-492）购自美国Santa Cruz 公司；兔源Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体（批号2772s）、兔源半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（批号9662s）、β-actin 抗体（批号4970s）、HRP 标记的山羊抗兔抗体购自美国CST 公司。

1.3 仪器

PAC 1000 电泳仪、FACSCanto 流式细胞仪、GelDoc XR＋凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；TS-8S 型双层脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；JY92-ⅡD 型超声波细胞破碎机（南京贝帝实验仪器有限公司）。

2 方法

2.1 分组与给药

SD 大鼠随机分为对照组、模型组及槐定碱低、中、高剂量（2.5、5.0、10.0 mg/kg）组[4]，每组14只。槐定碱溶于0.9%氯化钠溶液，分别配制成质量浓度为2.5、5.0、10.0 mg/mL 的溶液。各给药组ip相应溶液（1 mL/kg），对照组和模型组ip 等体积0.9%氯化钠溶液，1 次/d，连续5 d。末次给药后，模型组和各给药组立即制备pMCAO 模型。

2.2 pMCAO 模型的制备

采用Longa 改良线栓法[6]建立大鼠pMCAO 模型，大鼠ip 20%乌拉坦（6 mL/kg）麻醉后，于颈部正中切口并进行动脉分离，结扎右侧颈总动脉近心端，在颈内动脉下方穿线备用；在右侧颈总动脉距离分叉约4 mm 处剪口，将栓线经过颈内动脉插入大脑中动脉起始端（栓线最远端距分叉处18～20 mm），阻断大脑中动脉供血；结扎颈内动脉固定拴线，记录时间作为大脑局灶性缺血开始的时间，线栓阻断血流24 h。对照组仅进行动脉分离，不插线。

2.3 槐定碱对pMCAO 大鼠神经功能评分的影响

术后大鼠进行神经行为症状评分，判定神经功能损伤程度[6]。评分标准：0 分为大鼠无神经功能缺失症状；1 分为大鼠梗死对侧前爪内收、不能伸展对侧前肢；2 分为大鼠前肢屈曲对侧抵抗推力下降，行走时向偏瘫侧旋转；3 分为大鼠行走时向偏瘫侧倾倒；4 分为大鼠不能自发行走，意识丧失。

2.4 槐定碱对pMCAO 大鼠脑梗死率的影响

术后各组随机选取5 只大鼠，断头处死，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，以2 mm 为间隔行脑组织冠状切片，于2% TTC 染液中避光孵育30 min，于4%多聚甲醛溶液中固定1 h，拍照并观察梗死情况，红色区域为正常脑组织，白色区域为梗死病变的脑组织，采用Image J 软件计算脑梗死率[7]。

2.5 槐定碱对pMCAO 大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响

大鼠ip 20%乌拉坦麻醉，打开胸腔，用200 mL 4%多聚甲醛进行心脏灌注。大鼠断头处死，取60 mg大脑缺血半暗带区组织，即右侧大脑半球距离嗅球尖端7～11 mm 额顶皮质上部，制成单细胞悬液，调整细胞密度至1×109/L，2000 r/min 离心5 min，弃上清，细胞沉淀加入5 μL Annexin V-FITC 和PI，避光孵育，再加入490 μL 1×Binding Buffer，采用流式细胞仪于1 h 内检测细胞凋亡情况[8]。

2.6 槐定碱对pMCAO 大鼠脑组织病理变化的影响

大鼠断头取脑，取缺血部位脑组织，于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水、无水乙醇及二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后切片（厚5 μm），冠状切片贴于载玻片上，于4 ℃保存；石蜡切片经脱蜡、染色、脱水、透明后，中性树脂封片，于显微镜下观察脑组织病理变化。

2.7 槐定碱对pMCAO 大鼠脑组织Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表达的影响

取大鼠缺血部位脑组织，于液氮中研碎，加入裂解液提取总蛋白，采用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，于5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入Bcl-2、Bax、Caspase-3 和β-actin 抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔抗体室温孵育2 h，加入ECL 试剂显影，采用Quantity One 软件分析。

2.8 统计学处理

数据以±s表示，采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两之间比较采用最小显著差数法。

3 结果

3.1 槐定碱对pMCAO 大鼠神经功能评分的影响

如表1 所示，对照组大鼠神经功能正常，模型组大鼠出现缺血对侧前肢不能伸直、转圈等不同程度的神经缺陷症状。与模型组相比，各给药组大鼠神经缺陷症状得到改善。

3.2 槐定碱对pMCAO 大鼠脑梗死率的影响

如图1 所示，与对照组比较，模型组大鼠脑梗死率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，槐定碱中、高剂量组大鼠脑梗死率显著降低（P＜0.05、0.01）。

3.3 槐定碱对pMCAO 大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响

如图2 所示，与对照组比较，模型组大鼠缺血半暗带细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带细胞凋亡率明显降低（P＜0.05、0.01）。

表1 槐定碱对pMCAO 大鼠神经功能评分的影响 (± s, n = 14)Table 1 Effect of sophoridine on neurological score in pMCAO rats (± s, n = 14)

表1 槐定碱对pMCAO 大鼠神经功能评分的影响 (± s, n = 14)Table 1 Effect of sophoridine on neurological score in pMCAO rats (± s, n = 14)

剂量/(mg·kg-1) 0 分 1 分 神经功2 分能 评 分 3 分 — 14 0 0 0 — 0 0 3 8 组别 4 分 对照 0 模型 3 槐定碱 2.5 0 1 6 7 0 5.0 0 1 9 4 0 10.0 0 3 9 2 0

图1 槐定碱对pMCAO 大鼠脑梗死率的影响 ( ± s , n=5)Fig.1 Effect of sophoridine on cerebral infarction rate in pMCAO rats ( ± s , n=5)

图2 槐定碱对pMCAO 大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响 (± s, n = 9)Fig.2 Effect of sophoridine on apoptosis of ischemic penumbra in pMCAO rats (± s, n = 9)

3.4 槐定碱对pMCAO 大鼠脑组织病理变化的影响

如图3 所示，对照组大鼠大脑皮质结构完整，神经细胞排列及形态正常，胞膜完整，胞质丰富，核仁清楚；模型组大鼠大脑皮质广泛水肿，细胞排列紊乱，胞质空泡样变，部分核固缩，核仁消失，神经元数目明显减少，间质血管扩张充血，炎性细胞浸润；与模型组相比，各给药组大鼠脑组织水肿减轻，神经细胞形态有所改善，核固缩和核溶解程度减轻，细胞凋亡与坏死减少，神经元数目增加。

图3 槐定碱对pMCAO 大鼠脑组织病理变化的影响Fig.3 Effect of sophoridine on pathological changes of brain tissue in pMCAO rats

3.5 槐定碱对大鼠pMCAO 脑组织Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表达的影响

如图4 所示，与对照组比较，模型组大鼠脑组织Bcl-2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Bax和Caspase-3 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织Bcl-2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），Bax 蛋白表达水平 显著降低（P＜0.05、0.01），槐定碱中、高剂量组Caspase-3 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。

图4 槐定碱对pMCAO 大鼠脑组织Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表达的影响 (± s, n = 9)Fig.4 Effect of sophoridine on expressions of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in brain tissue of pMCAO rats (± s, n = 9)

4 讨论

缺血性脑卒中是临床上常见且多发的疾病，其病理过程涉及脑组织能量代谢障碍、神经细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎性反应、细胞凋亡等多个环节，其中神经细胞凋亡是脑缺血损伤的重要环节[9]。脑细胞缺血缺氧后，脑梗死区域与正常脑组织间存在以细胞凋亡为主的缺血半暗带区，通过调节该区域神经细胞的凋亡，能够有效减少神经细胞坏死数量和梗死区域面积，减轻神经功能损伤[10]。因此，及时、有效地阻止脑缺血后神经细胞凋亡，对减轻脑缺血损伤尤为重要。研究发现，中药能够通过调节线粒体凋亡途径抑制细胞凋亡，从而发挥脑神经保护作用[11]。课题组前期研究发现，槐定碱对局灶性脑缺血大鼠模型具有神经保护作用。

Bcl-2 家族蛋白在线粒体介导的细胞凋亡中发挥着关键性作用，能够通过控制线粒体膜的通透性，影响凋亡相关因子的释放，进而调控细胞凋亡[12]。由线粒体释放的细胞色素C（cytochrome C，CytC）与凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）结合形成凋亡小体，进而促进Caspase 前体活化，启动Caspase 级联反应[13]。Caspase 家族是细胞凋亡的效应器，能够引发细胞骨架重排、DNA 断裂等细胞生化和形态学的改变，Caspase-3 是Caspase 级联反应下游最关键的凋亡执行蛋白酶，Caspase-3 的活化可引起细胞凋亡[14]。Bax 为促凋亡蛋白，能够增加线粒体外膜通透性，促进凋亡相关因子的释放；Bcl-2 为抗凋亡蛋白，通过与Bax形成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡作用[15]。研究发现，急性脑梗死患者血清中Bcl-2 表达明显下降[12]。Bcl-2 与Bax 之间的平衡维持着细胞凋亡的稳态，脑缺血后Bcl-2/Bax 下降，Caspase-3 被激活，进而导致凋亡的发生[16]。

本研究结果显示，脑缺血24 h 后大鼠神经功能缺陷症状明显且细胞凋亡率显著增加，槐定碱能够明显改善pMCAO 大鼠的神经功能症状，减小脑梗死率，降低缺血半暗带处细胞的凋亡率，减轻pMCAO 大鼠病理性损伤，维持细胞的正常形态，抑制神经细胞凋亡和坏死。大鼠局灶性脑缺血后神经细胞的死亡可能与Bcl-2、Bax 和Caspase-3 凋亡途径的激活有关，本研究发现，槐定碱能够抑制pMCAO 大鼠脑组织Bax 的上调和Bcl-2 的下调，维持Bcl-2 与Bax 之间的平衡，从而抑制Caspase-3的上调，从而抑制脑缺血后神经细胞凋亡。

综上，槐定碱能够通过改善脑细胞凋亡情况、减轻pMCAO 大鼠神经损伤程度，从而发挥神经保护作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突