响应面法优化桑葚-甘蔗汁复合饮料制备工艺及其抗氧化活性研究

李大成，韦巧艳，舒万鑫，李英容，蔡吉祥

（广西科技师范学院食品与生化工程学院，广西 来宾 546199）

甘蔗是乔本科的多年生草本植物，在我国广西、广东、云南等南方亚热带地区广泛种植。甘蔗含糖量高，而且富含人体容易缺乏的多种微量元素，其中铁元素的含量居水果之首，因此甘蔗常被人们称作“补血果”和“铁杆庄稼”[1-3]。随着人们生活水平的提高及对健康生活的追求，人们对天然饮料的需求也日渐增加。甘蔗汁中含有丰富的多酚及黄酮类物质，具有较好的抗氧化、抗炎和抗突变能力[4-5]。但是目前国内的甘蔗汁主要用于生产白砂糖，甘蔗制糖行业存在着产品单一的问题，限制了制糖行业的发展。

桑葚（mulberry）又名桑葚子、桑果、乌椹等，是荨麻目桑科桑属植物桑树的果穗。桑葚不仅含有人体所需的必需氨基酸和各类营养物质，而且具有抗氧化、预防心脑血管疾病、抑制癌细胞生长以及调节免疫等功效，被国家卫生部列为“既是食品又是药品”的“药食同源”的农产品之一[6-8]。但桑葚采摘期短、水分高、属于浆果类。不耐压、容易腐烂变质、不易贮藏和运输，一旦变质就会造成极大的资源浪费和环境污染。目前以甘蔗汁和桑葚汁为原料进行调配制备具有保健功效的桑葚-甘蔗汁复合饮料鲜有报道。本试验以甘蔗汁和桑葚汁为主要原料，加入茉莉花茶汤调节其风味，制备出一种新型的绿色保健型饮料。该试验不仅可以为甘蔗的综合利用提供新的途径，提高甘蔗及桑葚的附加值，同时可以有效地解决桑葚贮藏保鲜时间短的问题，为蔗汁复合饮料的研究开发提供必要的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

试验所需仪器型号及生产厂家见表1。

表1 仪器Table 1 The instrument

1.2 材料与试剂

试验所用材料与试剂见表2。

表2 试剂Table 2 Material

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 甘蔗汁的制备

取甘蔗浓缩汁25 g，定容到100 mL，混合均匀后备用。

1.3.2.2 桑葚汁及茉莉花茶汤的制备

取桑葚浓缩汁6.7 g，定容到100 mL，混合均匀后备用；取茉莉花茶3 g于烧杯中浸泡，按料液比1∶40（g/mL）加入蒸馏水，在85℃水浴锅中浸提10 min，冷却、过滤得到茉莉花茶汤[9]。

1.3.3 桑葚-甘蔗汁复合饮料单因素试验

以桑葚-甘蔗汁体积比3∶4、柠檬酸添加量1.5%、维生素C添加量4%、茉莉花茶汤添加量35%为固定工艺参数，以感官评分为指标，考察桑葚-甘蔗汁体积比（1∶6、2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1）、柠檬酸添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、维生素 C添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、茉莉花茶汤添加量（20%、25%、30%、35%、40%）4个主要影响因素对桑葚-甘蔗汁复合饮料口感的影响。

1.4 感官评分标准

根据GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》的相关规定，总分以100分记，各项所占比例为色泽∶气味∶口感∶组织状态=2∶3∶3∶2，筛选出 10 名成员组成评价小组，制定感官评价标准如表3所示。根据感官评价标准对复合饮料进行评分，并严格按照标准设置评价环境。

表3 桑葚-甘蔗汁复合饮料感官评价标准Table 3 Sensory evaluation criteria of mulberry-sugarcane juice complex beverage

1.5 响应面法优化桑葚-甘蔗汁复合饮料的配制

依据单因素试验确定不同因素的影响范围，以桑葚-甘蔗汁体积比、柠檬酸添加量、维生素C添加量和茉莉花茶汤添加量为考察对象，感官评分作为响应值，采用Design Expert8.0.6方法设计四因素三水平响应面试验，试验因素水平表见表4。

表4 响应面因素水平Table 4 Response surface factor level

1.6 桑葚-甘蔗汁复合饮料的抗氧化活性测定

1.6.1 桑葚-甘蔗汁复合饮料对DPPH自由基清除能力的测定

分别量取4 mL不同浓度梯度的桑葚-甘蔗汁复合饮料和0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，充分混匀后放置在阴暗处静置30 min，检测其在517 nm波长时的吸光度值A1，同时用乙醇作空白对照组，吸光度值记为A0，取4 mL复合饮料和4 mL乙醇溶液混匀按上述方法测定吸光值记为A2[10-11]。以抗坏血酸作为对照组，无水乙醇调零，重复3次取平均值。DPPH自由基清除率的计算公式如下[12]。

1.6.2 桑葚-甘蔗汁复合饮料对羟基自由基清除能力的测定

准确量取不同浓度梯度的桑葚-甘蔗汁复合饮料1 mL，依次分别加入2 mL 9.9 mmol/L FeSO4·7H2O、9.9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L过氧化氢溶液于比色管中定容至10 mL，于37℃水浴反应30 min，测定其在510 nm波长下的吸光度值Ax1[13-15]，以蒸馏水作参比，510 nm下测吸光值记为Ax0，量取不同浓度梯度的桑葚-甘蔗汁复合饮料1 mL，2 mL的9.9 mmol/L FeSO4·7H2O、9.9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液于比色管中定容至10 mL，按上述方法测定其吸光度值Ax2。以抗坏血酸作为对照组，重复3次取平均值。羟基自由基清除率的计算公式[16]。

1.7 数据处理

试验数据采用 Microsoft Excel 2016、Origin 2018和Design-Expert 8.0.6进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 桑葚-甘蔗汁体积比对复合饮料品质的影响

在柠檬酸添加量1.5%、维生素C添加量4%、茉莉花茶汤添加量35%的条件下，以蔗汁-桑葚体积比为变量，制备桑葚-甘蔗汁复合饮料，考察桑葚-甘蔗汁体积比对桑葚-甘蔗汁复合饮料感官评分的影响，结果见图1。

图1 桑葚汁和甘蔗汁体积比对复合饮料感官评分的影响Fig.1 Effect of the volume ratio of mulberry juice to sugarcane juice on sensory evaluation of compound beverage

由图1可知，当桑葚-甘蔗汁体积比在3∶4时，感官评分最高，为90.63分，口感酸甜适中，兼具两者风味，色泽透亮。甘蔗汁口感甜腻，桑葚汁口感偏酸涩，甘蔗汁比例较高时，甘蔗风味浓郁，但糖分含量会偏高，口感过于甜腻；桑葚汁比例较高时，桑葚风味过重，口感微甜偏酸涩，且颜色呈紫黑色，感官上不易被消费者接受，感官评分偏低。因此选择最佳桑葚-甘蔗汁体积比为 3∶4。

2.2 柠檬酸添加量对复合饮料品质的影响

在桑葚-甘蔗汁体积比3∶4、维生素C添加量4%、茉莉花茶汤添加量35%的条件下，以柠檬酸添加量为变量，制备桑葚-甘蔗汁复合饮料，考察柠檬酸添加量对桑葚-甘蔗汁复合饮料感官评分的影响，结果见图2。

图2 柠檬酸添加量对复合饮料感官评分的影响Fig.2 Effect of citric acid on sensory evaluation of compound beverage

柠檬酸作为抑菌剂和调节剂，具有降低饮料的pH值、抑制微生物繁殖，促进纤维素和钙、磷等物质溶解的作用[17]，但是柠檬酸呈酸味，对饮料风味和口感都有影响。由图2可知，柠檬酸添加量为1.5%时感官评分最高达到89.97分，在大于1.5%时，其感官评分呈现下降趋势。柠檬酸的添加量要达到一定量才具备抑菌和调节饮料口感的作用，但是添加量超过1.5%时，柠檬酸的酸味特性较为突显，饮料口感偏酸，掩盖甘蔗和桑葚的风味，导致复合饮料风味较差。因此选择最佳柠檬酸添加量为1.5%。

2.3 维生素C添加量对复合饮料品质的影响

在桑葚-甘蔗汁体积比3∶4、柠檬酸添加量1.5%、茉莉花茶汤添加量35%的条件下，以维生素C添加量为变量，制备桑葚-甘蔗汁复合饮料，考察维生素C添加量对桑葚-甘蔗汁复合饮料感官评分的影响，结果见图3。

图3 维生素C添加量对复合饮料感官评分的影响Fig.3 Effects of vitamin C supplementation on sensory evaluation of compound beverages

维生素C具有防止饮料发生褐变和营养成分损失的作用[18]，由图3可知，当维生素C添加量增大到4%时，感官评分达到最高90.1分，当维生素C小于4%时，复合饮料的颜色比较偏紫黑色，感官上不易被接受；而当维生素C添加量超过4%后，则会导致饮料的pH值降低，不能够遮盖桑葚的苦涩味，还改变了饮料的风味[19-21]，导致复合饮料的感官评价值下降。因此选择最佳维生素C添加量为4%。

2.4 茉莉花茶汤添加量对复合饮料品质的影响

在桑葚-甘蔗汁体积比3∶4、柠檬酸添加量1.5%、维生素C添加量4%的条件下，以茉莉花茶汤添加量为变量，制备桑葚-甘蔗汁复合饮料，考察茉莉花茶汤添加量对桑葚-甘蔗汁复合饮料感官评分的影响，结果见图4。

图4 茉莉花茶汤添加量对复合饮料感官评分的影响Fig.4 Effect of adding amount of jasmine tea soup on sensory evaluation of compound beverage

由图4可知，当茉莉花茶添加量在20%～40%时，其感官评分呈现先上升后下降的趋势，当茉莉花茶汤的添加量为35%时，感官评分最高达到91分，桑葚-甘蔗汁复合饮料的酸甜口感适中，风味香气适宜。

茉莉花茶汤可以赋予饮料清新的香气，调节和掩盖桑葚、甘蔗汁的苦涩味。茉莉花汤过多，茉莉花香气完全掩盖桑葚、甘蔗的特殊风味，导致口感不适宜饮用；茉莉花茶汤过少，茉莉花香气无法中和甘蔗汁的甜腻，也无法掩盖桑葚汁的酸涩味，导致各种风味无法融合，口感复杂，感官评价得分较低。因此选择最佳茉莉花茶汤的添加量为35%。

2.5 响应面试验

利用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验进行设计，结果如表5所示。

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

对表5进行拟合回归，得到桑葚-甘蔗汁复合饮料感官评分与各因素变量（A桑葚-甘蔗汁体积比、B柠檬酸添加量、C维生素C添加量、D茉莉花茶汤添加量、Y感官评分）之间的二元回归方程：Y=91.4+2.947A-2.43B-0.8C-1.858D-9.888A2-9.25B2-4.925C2-7.463D2+2.275AC+2.875AD-0.725AB+2.125BC+2.9BD。

进一步对表5试验结果进行方差分析，结果如表6所示。

表6 Box-Behnken试验模型方差分析Table 6 Box-behnken experimental model analysis of variance

由表6可知，该试验模型方差极显著（p<0.01），失拟项不显著（p=0.123 4>0.05），因此该模型可以反映各因素对桑葚-甘蔗汁复合饮料的影响。该回归模型的决定系数R2=0.973 7，R2Adj=0.947 3，说明该回归模型与试验数值的拟合度程度较高，进一步说明该回归方程可以对桑葚-甘蔗汁复合饮料的感官评价进行分析和预测。由F值可知各因素对响应值影响的主次顺序为：A桑葚-甘蔗汁体积比>B柠檬酸添加量>D茉莉花茶汤添加量>C维生素C添加量。影响感官评分的因素中，一次项 A、B，二次项 A2、B2、C2、D2都是极显著水平（p<0.01），而一次项D以及交互项AD、BD是显著水平（p<0.05），而其他结果影响不显著（p>0.05）。

各因素之间的交互作用可以由响应面直接反映，椭圆形等高线表示两个因素间的交互作用明显，圆形表示两因素间的交互作用不明显[22]。根据二元回归方程绘制三维响应面图和二维等高线图，结果如图5、图6所示。

图5 茉莉花茶汤添加量与桑葚-甘蔗汁体积比对复合饮料感官评分的等高线及响应值Fig.5 Contour line and response value of sensory score of compound beverage by adding amount of jasmine tea soup and mulberries-sugarcane juice volume ratio

图6 柠檬酸添加量与茉莉花茶汤添加量对复合饮料感官评分的等高线及响应值Fig.6 Contour line and response value of adding amount of citric acid and jasmine tea soup to sensory score of compound beverage

由图5、图6可以看出，AD、BD的交互作用对复合饮料的感官评价值具有显著影响，而其他的交互作用都不显著，且图5、图6的三维立体图响应面的开口朝下，表明响应面具有最大值，在试验范围内有最优配方。

应用Design-Expert 8.0.6软件对回归方程分析，得到的最优响应面结果为：桑葚-甘蔗汁体积比为3：4，柠檬酸添加量1.4%，维生素C添加量4%，茉莉花茶汤添加量34.27%，对应的感官评分为91.877 6分。根据实际情况调整茉莉花茶汤添加量为34%，在此条件下进行饮料复配得到的感官评分值的平均值为90.72分，与预测值相接近，故该响应面优化模型所得到的工艺参数的可靠性高。

2.6 桑葚-甘蔗汁复合饮料对DPPH自由基清除能力分析

以抗坏血酸作为对照组，考察桑葚-甘蔗汁复合饮料对DPPH自由基清除能力，结果如图7、图8所示。

图7 复合饮料对DPPH自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of compound beverage on DPPH free radical

图8 抗坏血酸对DPPH自由基的清除效果Fig.8 The scavenging effect of ascorbic acid on DPPH free radical

由图7可知，桑葚-甘蔗汁复合饮料的浓度在0.2g/L～1.8g/L的范围内，桑葚-甘蔗汁复合饮料对DPPH自由基清除能力随着溶液浓度增大而提高。通过线性拟合得到桑葚-甘蔗汁复合饮料的溶液质量浓度与DPPH自由基清除率的线性方程是：y=0.422 5x+0.041（R2=0.998 1），IC50=1.086 g/L。由图8可知，抗坏血酸的溶液的质量浓度与DPPH自由基清除率的线性方程为：y=31.75x-0.1099（R2=0.9929），IC50=0.019 g/L。桑葚-甘蔗汁复合饮料的质量浓度在料浓度在1.8 g/L时，DPPH自由基清除率达到78.93%，表明复合饮料具有抗氧化性，但其清除DPPH自由基的能力比抗坏血酸的弱。

2.7 桑葚-甘蔗汁复合饮料对羟基自由基清除能力分析

以抗坏血酸作为对照组，考察桑葚-甘蔗汁复合饮料对羟基自由基清除能力。结果如图9、图10所示。

图9 复合饮料对羟基自由基的清除效果Fig.9 The scavenging effect of compound beverage on hydroxyl radical

图10 抗坏血酸的羟基自由基的清除效果Fig.10 Scavenging effect of hydroxyl radical of ascorbic acid

由图9可知，桑葚-甘蔗汁复合饮料的浓度在15g/L～75 g/L的范围内，桑葚-甘蔗汁复合饮料对羟基自由基清除能力随着溶液浓度增大而提高。通过线性拟合得到桑葚-甘蔗汁复合饮料的溶液质量浓度与羟基自由基清除率的线性方程是：y=0.011 2x+0.048 7（R2=0.986 1），IC50=40.29 g/L。由图10可知，抗坏血酸的溶液浓度与羟基自由基清除率的线性方程是：y=0.349 3x-0.032 5（R2=0.996 6），IC50=1.52 g/L。桑葚-甘蔗汁复合饮料的质量浓度在料浓度在80 g/L时，羟基自由基清除率达到87.74%，表明复合饮料具有抗氧化性，但其清除羟基自由基的能力比抗坏血酸的弱。

3 结论

通过单因素试验和响应面法，对桑葚-甘蔗汁复合饮料进行感官评价。结果表明最佳配方为：桑葚汁和甘蔗汁体积比为3∶4，柠檬酸添加量为1.4%，茉莉花茶汤添加量为34%，维生素C添加量为4%，在此条件下，桑葚-甘蔗汁复合饮料的感官评价得分为90.72分，此时复合饮料的色泽呈现紫红色，酸甜适中，带有浓浓的茉莉花茶的香气。在此最优条件下，对桑葚-甘蔗汁复合饮料进行体外抗氧化试验，结果表明桑葚-甘蔗汁复合饮对DPPH自由基和羟基自由基具有较强的清除能力。