EPS8L3对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响及作用机制

劳征虹 吴云红 毛华君 管亮

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤。尽管近年来乳腺癌的诊治方法不断改进，但仍是危害女性生命健康的重要疾病，其发病机制仍有待探索[1]。Rac1是小GTP结合蛋白，在多种类型细胞骨架蛋白重构和特异性基因表达中起调控作用。表皮生长因子受体激酶底物8样蛋白（epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein,EPS8L）是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路细胞内底物，包括 EPS8、EPS8L1、EPS8L2 和 EPS8L3，均由 N 端磷酸结合蛋白（phosphotyrosine binding protein,PTB）区域、中间真核生物蛋白结构域（Src homology domain 3,SH3）和C端“效应区域”组成[2]。EPS8在多种实体瘤中表达升高，包括乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌和口腔癌，并影响多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭转移[3]。研究发现，EPS8可与Sos-1、Abi-1形成复合物参与Ras-Rac信号通路，从而介导细胞骨架蛋白的重组和血管生成[4-6]；同时还可调节基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）的表达与活化、降解细胞外基质，协同CXC趋化因子促进肿瘤细胞的迁移[7-8]。此外，研究发现，EPS8-Sos-1-Abi-1复合物的形成可调控EGFR介导蛋白激酶B（protein B,AKT）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）的激活，促进Ras-Rac信号传导，加强细胞的迁移能力[9-10]。EPS8L3与EPS8具有类似的主要功能结构，但与肿瘤相关的研究报道不多。本研究旨在探讨EPS8L3对乳腺癌细胞迁移、侵袭的影响，并分析可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 乳腺癌细胞株MAD-MB-231购自中国科学院上海细胞生物研究所。小牛血清、抗生素、DMEM培养基、PBS和含0.02%的胰酶购自美国GE公司。Trizol购自美国 Invitrogen公司，PrimeScriptTMⅣ 1st strand cDNA Synthesis Mix购自日本Takara公司。RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自中国碧云天生物技术公司。红外荧光成像系统购自美国LI-COR公司。Matrigel基质胶购自美国BD生物科学公司，Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养 细胞培养于含10% FBS、1%抗生素（含100 U/ml青霉素和 100 mg/ml链霉素）和 2 mmol/L谷胺酰胺的 DMEM 培养液中，在 37℃、5% CO2、湿度为95%的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞，用含0.02% EDTA的胰酶消化1 min，用含10%小牛血清的DMEM培养液稀释成单细胞悬液（106/ml），以4 000个细胞/孔接种于直径为6 cm的培养皿中。细胞生长至80%～90%融合时提取总RNA和蛋白。重复实验3次。

1.3 shRNA设计合成和转染 shRNA1-EPS8L3和shRNA2-EPS8L3引物设计与合成由广州锐博公司完成。按Lipofectamine3000说明使用shRNA转染乳腺癌MAD-MB-231细胞，shRNA转染后48 h更换为加入400μg/ml G418培养基，筛选 5 d后改为200μg/ml G418培养基维持培养，筛选细胞命名为shRNA1-EPS8L3组和shRNA2-EPS8L3组，空白对照细胞为shRNA-NC组。转染24 h后提取RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot检测相关基因mRNA和蛋白表达情况。

1.4 各组细胞EPS8L3、Rac1 mRNA表达情况检测 采用qRT-PCR法。根据Trizol说明书提取细胞RNA后用PrimeScriptTMⅣ 1st strand cDNA Synthesis Mix试剂盒进行逆转录反应，生成的cDNA存于4℃或直接用于定量PCR。定量PCR条件为：95℃，30 s（1个循环），95℃、5 s，55 ℃、20 s（30 个循环），95 ℃、0 s，65 ℃、15 s，95 ℃、0 s。引物序列：EPS8L3-F：5'-CTGCTACAGTCCTGTCTAAGCC-3'；EPS8L3-R：5'-GAGAATGTGGGTTGGTAGGGCA-3'；Rac1-F：5'-CGGTGAATCTGGGCTTATGGGA-3'；Rac1-R：5'-GGAGGTTATATCCTTACCGTACG-3'；GAPDH-F：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；GAPDH-R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。以 2-ΔΔCt法计算mRNA表达水平。实验重复3次。

1.5 各组细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白表达检测 采用Western blot法。对数期生长的细胞洗涤后加入适当体积的RIPA裂解液，冰浴30 min，12 000g离心5 min，收集上清液后用BCA试剂盒检测蛋白浓度。以每孔20μg蛋白进行SDS凝胶电泳，浓缩胶电压75 V，分离胶用120 V，电泳至溴酚蓝跑出即可终止电泳。随后在300 mA恒流下转膜1 h，将蛋白转至PVDF膜。转膜后用5%磷酸盐吐温缓冲液封闭1 h，4℃下加入鼠抗人或兔抗人一抗孵育过夜，洗涤后再用二抗孵育30min。洗涤后在红外荧光成像系统中检测蛋白表达水平。实验重复3次。

1.6 各组细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。各组细胞用胰酶消化后以5×105/孔的密度接种至六孔板中，用20μl枪头均匀在孔中划痕，用PBS洗涤3次去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃、5% CO2培养箱培养48 h后取出细胞，在显微镜下观察并拍照统计迁移的细胞数。实验重复3次。

1.7 各组细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验。各组细胞用胰酶消化后用无血清培养基重悬，取200μl 5×105细胞悬液加入Matrigel包被基底膜的Transwell小室上室，下室加入600μl含FBS的培养基。接种后继续置于37℃、5% CO2培养箱中培养48 h，取出小室，PBS洗涤后加入4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫溶液染色15 min。倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，统计侵袭的细胞数，取平均值。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞EPS8L3 mRNA表达水平比较 与shRNANC组相比，shRNA1-EPS8L3组和shRNA2-EPS8L3组细胞EPS8L3 mRNA表达水平均降低（均P＜0.05），见图1。

图1 各组细胞EPS8L3 mRNA表达水平比较

2.2 各组细胞迁移、侵袭能力比较 shRNA1-EPS8L3组、shRNA2-EPS8L3组、shRNA-NC组迁移细胞数分别为（232.00±16.00）、（324.70±21.20）、（514.70±6.11）个，侵袭细胞数分别为（338.70±11.37）、（384.70±13.01）、（501.30±19.01）个。与 shRNA-NC 组相比，shRNA1-EPS8L3组和shRNA2-EPS8L3组细胞迁移、侵袭能力均减弱（均P＜0.05）。EPS8L3表达降低后能抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭能力。提示随着乳腺癌细胞EPS8L3表达下调，乳腺癌细胞迁移、侵袭能力受抑制。见图2。

图2 各组细胞迁移、侵袭能力比较（a为各组细胞迁移能力比较；b为各组细胞侵袭能力比较，*P＜0.05）

2.3 各组细胞EMT相关蛋白表达水平比较 与shRNANC组相比，shRNA1-EPS8L3组和shRNA2-EPS8L3组上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-Cadherin）表达上调（均P＜0.05），间质细胞标志物波形蛋白（Vimentin）、纤黏蛋白（Fibronectin）表达下调（均P＜0.05），见图3。提示EPS8L3表达下调可能抑制乳腺癌细胞的EMT过程。

图3 各组细胞上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达电泳图（a）及水平（b）比较

2.4 各组细胞Rac1 mRNA表达水平比较 与shRNANC组相比，shRNA1-EPS8L3组和shRNA2-EPS8L3组细胞Rac1 mRNA表达水平均降低（均P＜0.05），见图4，提示乳腺癌细胞随着EPS8L3表达下调，Rac1表达也下调。

图4 各组细胞Rac1 mRNA表达水平比较（*P＜0.05）

3 讨论

EPS8表达升高与多种肿瘤相关。在胰腺癌细胞中，EPS8表达明显升高，且与细胞迁移能力呈正相关[11]。在宫颈癌组织中，EPS8表达显著升高，且与Vimentin表达呈正相关，与E-cadherin表达呈负相关，和肿瘤转移密切相关[12]。在口腔癌组织中，ESP8在32%原发肿瘤组织中表达升高，与淋巴结转移有密切关联[13]。EPS8L3与EPS8具有类似的主要功能区域和不同的氨基酸长度，主要与遗传性稀毛症有关，在肿瘤研究中的报道不多，在肝细胞癌中表达升高，并与病理分级及不良预后相关[14]。因此，笔者推测EPS8L3与EPS8类似，可能在乳腺癌中促进肿瘤发展。本研究结果也支持这一观点，EPS8L3表达下调可以抑制乳腺癌细胞迁移和转移，影响EMT相关蛋白表达，提示EPS8L3可能通过刺激EMT过程加速乳腺癌的侵袭和转移，且EPS8L3可能通过Rac1促进乳腺癌的EMT和侵袭转移。

EPS8与肿瘤发生和增殖密切相关，能通过刺激Ras/ERK、AKT/FOXM1和MTOR/STAT3等下游通路促进肿瘤生长。此外，通过与Abi-1-Sos-1和IRSp53形成复合物，ESP8可以激活Rac，引起actin重建，从而促进肿瘤迁移。EPS8过表达也可以通过AKT通路刺激MMP-9生成和肿瘤侵袭。因此，EPS8L3可能通过与EPS8类似的保守区域刺激Rac1，促进乳腺癌侵袭转移[3]。

Rac1是一种Rho家族的小GTP结合蛋白，具有Rho家族蛋白的鸟苷三磷酸酶结合区，与二磷酸鸟嘌呤核苷（guanosine diphosphate,GDP）和三磷酸鸟嘌呤核苷（guanosine triphosphate,GTP）具有高度的亲和性。Rac1在细胞内信号传导中起到重要作用，具有分子开关的作用，与GDP结合时失活，与GTP结合时激活[15]，从而对肿瘤细胞周期、运动、转移和EMT等进行调节。在乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、头颈癌等多种肿瘤中检测到Rac1过表达或过度激活[16]。Rac1与肿瘤细胞的EMT息息相关，并且在调节蛋白重组中有重要意义。研究发现，转化生长因子-β通过Rac1-NOXs-活性氧通路[17]和 Rac1/活性氧/核因子 κβ/IL-6/MMP-2通路[18]调节MMP-9和MMP-2的活性，诱导EMT的发生。此外，Rac1还可通过磷脂酰肌醇3激酶/c-Jun氨基末端激酶通路上调N-钙黏蛋白，诱导EMT的发生[19]。Rac1可以通过Ras GTP酶活化类似蛋白IQ域GTP酶激活蛋白1与上游的蛋白相互作用[20]，诱导EMT发生。

综上所述，本研究结果表明，EPS8L3可能通过影响Rac1通路诱导EMT过程发生和肿瘤细胞侵袭、转移，从而促进乳腺癌发生、发展。