哺乳动物不育系20样激酶1表达水平与宫颈癌相关病理学参数的关联性

韩芳芳，孙鑫，沈志强

(黄河水利委员会黄河中心医院 病理科，河南 郑州 450000)

宫颈癌为女性常见恶性肿瘤，近年随着医学筛查技术发展及人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)预防性疫苗的应用，宫颈癌发病率有所降低，但呈现年轻化趋势[1-2]。目前临床治疗宫颈癌主要以手术或放化疗方案为主，但患者预后不够理想。因此，寻找特异性肿瘤生物学标志物对完善治疗方案具有重要意义。哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1，Mst1)为Hippo信号通路的核心成员之一，广泛存在于哺乳动物体内，可调节胚胎生长发育，抑制肿瘤生长，影响细胞周期，促进细胞凋亡。已有研究发现，Mst1在口腔鳞癌、乳腺癌、鼻咽癌、胃癌等多种恶性肿瘤中呈异常低表达，可能与肿瘤的发生发展有关[3-6]。本研究选取2011年1月至2019年12月黄河水利委员会黄河中心医院收治的80例宫颈癌患者作为研究对象，分析Mst1表达水平与宫颈癌相关病理学参数的关联性，为宫颈癌的治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2011年1月至2019年12月黄河水利委员会黄河中心医院收治的80例宫颈癌患者作为研究对象，均经手术病理证实，手术治疗时均取宫颈癌组织及配对癌旁组织(距肿瘤边缘≥4 cm处)为标本，术前未进行放疗或化疗，离体后立即置入液氮中保存，排除苏木精-伊红染色制作过程中出现掉片、滑片现象的病例。

1.2 研究方法

1.2.1免疫组化法 宫颈癌组织及癌旁组织标本以体积分数为4%的多聚甲醛固定，石蜡切片，采用免疫组化SP法检测，兔抗人Mst1单克隆抗体按照1∶100稀释。用磷酸盐缓冲液替代一抗进行阴性对照，已知阳性组织片为阳性对照组。兔抗人Mst1单克隆抗体由CST公司提供，免疫组化试剂盒由武汉博士德生物公司提供。根据细胞着色强度判定结果：棕黄色或黄褐色为2分，浅黄色为1分，无着色为0分。组织染色后细胞质出现棕黄色颗粒为Mst1阳性，40倍显微镜下每张切片随机选取5个视野，根据Mst1阳性表达细胞率评定，>75%为4分，51%～75%为3分，26%～<51%为2分，<26%为1分。最终得分为细胞着色得分和染色强度得分乘积，>4分为阳性，≤4分为阴性。

1.2.2Western blot法 取宫颈癌组织、癌旁组织，以NP-40裂解液冰上裂解30 min，期间每隔5 min震荡1次，以促进裂解，4 ℃下离心(时间15 min，转速12 000 r·min-1)，提取蛋白，以BCA法进行蛋白定量，取40 μg上样行SDS-PAGE电泳分离，转移蛋白至PVDF膜(120 mA恒流转膜)，以50 g·L-1的牛血清白蛋白室温封闭2 h，一抗Mst1(1∶500)及β-actin(1∶1 000)于4 ℃下过夜，次日用TBST洗膜，二抗(1∶5 000)于37 ℃环境中温育1 h，用TBST洗膜后以化学发光法显影检测。鼠抗人β-actin单克隆抗体及二抗均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，蛋白抽提试剂盒、化学发光试剂盒及蛋白水平检测试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。经灰度扫描仪分析获得各条带灰度值。以宫颈癌组织Mst1条带灰度值与对应的β-actin灰度值之比表示Mst1在宫颈癌组织中的表达量。

1.3 观察指标(1)宫颈癌组织及癌旁组织Mst1表达水平。(2)不同病理参数(年龄、肿瘤直径、组织学分型、分化程度、FIGO分期、是否有淋巴结转移)Mst1阳性表达率。(3)采用Spearman相关系数分析Mst1阳性表达率与FIGO分期的相关性。

2 结果

2.1 宫颈癌组织及癌旁组织Mst1表达水平宫颈癌组织Mst1表达水平(0.64±0.09)较癌旁组织(1.05±0.10)低，阳性表达率[27.50%(22/80)]较癌旁组织[80.00%(64/80)]低(P<0.05)。

2.2 宫颈癌不同病理学参数Mst1阳性表达率不同年龄、肿瘤直径、组织学分型、分化程度宫颈癌患者Mst1阳性表达率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；FIGO分期为ⅡB～Ⅳ期、有淋巴结转移宫颈癌患者Mst1阳性表达率低于FIGO分期为ⅠB～ⅡA期、无淋巴结转移宫颈癌患者(P<0.05)。见表1。

表1 宫颈癌不同病理学参数Mst1阳性表达情况 比较[n(%)]

2.3 Mst1阳性表达率与FIGO分期的相关性Spearman相关系数分析显示，Mst1阳性表达率与FIGO分期呈负相关(r=-0.601，P=0.012)。

3 讨论

相关统计数据显示，早期宫颈癌5 a生存率能达91.5%，局部淋巴结转移者5 a生存率下降至57.1%，但远处转移者5 a生存率仅为17.3%，可见转移是影响患者生存的重要因素[7-8]。因此，明确肿瘤发生、发展及转移的病理生理机制，对延长患者生存期尤为重要。

Hippo信号通路是一种抑癌通路，由多种抑癌基因及1种候选癌基因YAP组成，可维持细胞增殖与凋亡平衡，其中Mst1为其核心分子。Mst1被激活后进入细胞核，激活促凋亡的组蛋白、转录因子，抑制细胞生长，Mst1缺失时会抑制细胞凋亡。王淑丽等[9]研究表明，Mst1在宫颈癌中呈低表达，可作为宫颈癌临床治疗和预后判断新的靶点。本研究结果显示，宫颈癌组织Mst1表达水平、阳性表达率均低于癌旁组织，与上述研究结果相似，说明Mst1可能参与宫颈癌的发病。Mst1可通过磷酸化调节Hippo-YAP信号传导途径中的核心激酶反应链其余部分，参与细胞凋亡，使组织器官处于动态平衡，但外界刺激会导致Mst1磷酸化活性减弱，致使细胞凋亡减少或增殖过度，引发恶性肿瘤。郑小影等[10]以虫草素处理宫颈癌细胞后发现，Hippo信号通路的关键蛋白Mst1表达上调，从而抑制癌细胞增殖，促进其凋亡。李华等[11]研究证实，牛磺酸通过上调Mst1表达引起Bax蛋白表达上调和Bcl-2蛋白下调，诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡，从而对宫颈癌发挥治疗效果。本研究中FIGO分期为ⅡB～Ⅳ期、有淋巴结转移宫颈癌患者Mst1阳性表达率低于FIGO分期为ⅠB～ⅡA期、无淋巴结转移宫颈癌患者，进行Spearman相关系数分析发现，Mst1阳性表达率与FIGO分期呈负相关，可见Mst1与宫颈癌的增殖、转移等有关，参与肿瘤的发生、进展，可能是由于Mst1表达水平降低，使机体降低或失去对宫颈癌的抑制作用。因此，可考虑将上调Mst1表达作为治疗宫颈癌的新途径。

综上可知，Mst1在宫颈癌中呈异常低表达，参与肿瘤的发生、进展，可作为评估宫颈癌病情程度的重要指标，为临床诊治提供参考依据。