8株拮抗细菌及其组合对苹果树腐烂病的防治效果

郑雪晴，王 帆,2，杨军玉，韩泽园，王亚南，曹克强，王树桐

（1. 河北农业大学 植物保护学院/植物病害流行与综合防治实验室，河北 保定 071001；2. 蔚县气象局，河北 张家口 075700）

由黑腐皮壳属（Valsa maliMayabe et Yamada）引起的苹果树腐烂病是一种毁灭性病害［1］，严重威胁我国苹果产业［2］。生产上以使用传统的化学杀菌剂来控制腐烂病发展，化学农药的大量使用也给环境生态造成了巨大压力［3］。因此，需要一种更安全、更长效病害控制措施［4］，生物防治或是一种理想的替代方法。

生物防治主要是利用细菌、真菌及其它微生物来抑制病原菌的生长［5］，促进植物健康生长等［6］，目前一些微生物已被研究作为真菌病害生物防治的候选菌株［7］。在苹果树腐烂病生物防治研究领域，邓振山等［8］筛选出的拮抗内生真菌；薛应钰等［9］从苹果根际土壤中筛选得到的放线菌菌株均对苹果树腐烂病菌有较强的拮抗作用。在细菌研究方面，以芽胞杆菌类应用最为广泛［10］，豆雅楠等［11］从敦煌盐碱地中分离出的枯草芽胞杆菌亚种(Bacillus subtilissubsp.spizizenii)发酵原液在离体枝条试验中可以完全抑制腐烂病菌生长；何姣等［12］分离出的解淀粉芽胞杆菌能有效抑制苹果树腐烂病菌，有一定的生防潜力。但这些菌株多为单一菌株，存在诸如菌株作用谱窄、持效性差、环境依赖性强等弊端,不能达到理想的防病效果［13］。因此, 通过菌剂组合来提高生防效果和稳定性、延长生防菌的作用期限显得尤为重要。

本研究通过室内和田间试验系统测试了前期筛选获得的8株细菌对腐烂病菌的拮抗作用及对苹果枝条伤口的促愈作用；将拮抗效果突出的菌株与促愈效果突出的菌株两两组合，通过离体苹果枝条和田间试验分别测试了8株单一菌株与菌株组合对腐烂病的防治效果，以期为苹果树腐烂病生物防治提供材料和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：苹果树腐烂病菌（Valsa mali）Vmm41，解淀粉芽胞杆菌（B. amyloliquefaciens）X-1、Y5、BV2007和ND-7菌株，贝莱斯芽胞杆菌（B. velezensis）X-2、X-3、X-4和40-6，均由本实验室提供。

供试枝条：2～3年生健康富士苹果枝条，于0～3 ℃ 冷库中短期保存备用。

1.2 生防菌菌株发酵液的制备

用灭菌牙签挑取供试生防菌菌株单菌落接种于50 mL LB液体培养基中，28 ℃，220 r/min震荡培养48 h制成种子液；取种子液5 mL接种于80 mL LB液体培养基中，继续震荡培养48 h制备成细菌发酵液。

1.3 8株生防菌对腐烂病菌菌丝形态的影响

参照Zhou Ting［14］的试验方法制备载玻片。在含有载玻片的平皿里倒入PDA培养基，凝固后将载玻片取出，放入新的培养皿中，将滴有20 μL发酵液的滤纸片与腐烂病菌放在载玻片两端，相距3.5 cm，以无菌水为对照，设4次重复，25 ℃培养,4 d后用显微镜观察病原菌菌丝形态。

1.4 8株生防菌对腐烂病的防治效果

在试验果园选取2～3年生富士苹果枝条，在枝条表面打圆孔（ø=8.0 mm），分别接种Y5、BV2007、X-1、X-2、X-4、X-3、40-6和ND-7的发酵液50 μL（1×109CFU/mL），保鲜膜包裹保湿。每个重复10棵树，每处理重复5次，每棵树10个接种点。以无菌水和3%甲基硫菌灵作为空白对照和阳性对照。3个月后观察记录接种点的愈合情况。

伤口愈合度=（原伤口面积－愈合剩余面积）/原伤口面积

促愈效果（%）=（处理的伤口愈合度－对照的伤口愈合度）/对照的伤口愈合度×100%

1.5 离体枝条试验

采集2～3年生枝条，剪取30 cm长的枝段，用75%的酒精浸泡后，用3%的次氯酸钠消毒，无菌水冲洗，枝段两端用液体石蜡封口，晾干。用打孔器（ø=8.0 mm）在枝条表面打孔，每组处理5根枝条，每根枝条3个接种点。用无菌水、3%甲基硫菌灵药剂作为空白对照和阳性对照。

1.5.1 预防效果测试 分别滴加50 μL单株或组合生防菌菌液（1×109CFU/mL）于孔内，晾干后接种腐烂菌菌饼，用保鲜膜包裹，将离体枝条插在灭菌的湿沙粒中，48 h后去除保鲜膜和菌饼。待空白对照组全部发病后测量病斑大小，计算病斑面积。根据调查结果统计发病面积、发病率并计算防治效果。

1.5.2 治疗效果测试 在打孔处接种腐烂病菌菌饼，保鲜膜包裹保湿，25 ℃培养，待接种部位发病后（约60 h）刮除病斑，涂抹单株或组合生防菌菌液50 μL（1×109CFU/mL），晾干后继续保湿培养。待空白对照组病斑全部复发后测量病斑大小，计算发病率、病斑面积和防治效果。

发病率=病斑数/处理数×100%

病斑面积=1/4×π×长径×短径

复发病斑面积=第二次测量病斑面积－第一次测量病斑面积

防治效果=（对照组复发病斑面积－处理组复发病斑面积）/对照组复发病斑面积×100%

1.6 田间试验

选取长势相近的30棵盆栽富士树，选2～3年生健康枝条，在枝条表面打圆孔（ø=8.0 mm）。以无菌水、3%甲基硫菌灵分别作空白对照和阳性对照。1.6.1 预防效果测试 分别滴加50 μL组合生防菌菌液（1×109CFU/mL）于孔内，保鲜膜包裹。3 d后接种腐烂病菌菌饼（ø=8.0 mm），再包裹7 d，每重复3个接种点，每处理重复5次。观察记录接种点的发病情况，计算病斑面积和防治效果。

1.6.2 治疗效果测试 在处理后枝条的打孔处接种腐烂病菌菌饼（ø=8.0 mm），保鲜膜包裹，约7 d后接种部位显症，用刮刀将病斑全部刮净，涂抹50 μL组合生防菌菌液（1×109CFU/mL）保鲜膜包裹保湿，待对照组发病后观察腐烂病的复发情况，计算发病率、病斑面积和防治效果。计算方法同上。

1.7 数据统计与分析

本试验所有数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差法分析，利用LSD法和Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验，置信度p=0.05。

2 结果与分析

2.1 8株生防菌对腐烂病菌菌丝生长的拮抗作用以及对枝条伤口的促愈作用

8株生防菌均对苹果树腐烂病菌菌丝生长有明显抑制效果，其中X-1、Y5和BV200菌株抑菌率较高，均达到55%以上，为拮抗菌株。田间试验结果表明，8株生防菌对枝条伤口愈合均有不同程度促进作用，其中菌株X-2、ND-7、BV2007和X-3的促愈效果均为25% 以上，显著高于清水对照，与甲基硫菌灵的促愈效果无显著差异（P＜0.05），为促生菌株（见表1）。

表1 8株生防菌对腐烂病菌的拮抗作用以及对苹果枝条伤口的促愈作用Table 1 Antagonistic effect of eight strains of biocontrol bacterial strains on Valsa mali and their effect of promoting the healing of apple branch wound

2.2 8株生防菌株对病原真菌菌丝形态的影响

通过显微观察发现，正常培养的腐烂病菌菌丝粗细均匀、表面光滑，菌丝细长（图1-a）；而与8株生防菌对峙培养4 d后的腐烂病菌菌丝从顶端数第一个分支与第二个分支间菌丝长度缩短、菌丝不规则，弯曲、分支增多、变粗（图1-b～i）。表明生防菌产生的拮抗物质对腐烂病菌菌丝的形态有明显影响。

图1 菌丝形态观察图Fig.1 Mycelial morphology

2.3 离体枝条测定生防菌株组合菌液对苹果树腐烂病的防治效果

通过离体枝条试验测试了11个生防菌株组合与6个单一菌株菌液对腐烂病离体枝条的治疗效果和预防效果。结果表明，Y5+ND-7、Y5+BV2007、BV2007+ND-7、BV2007+X-2的治疗效果分别为52.32%、44.78%、43.53%和41.75%，其 余 菌 株组合的防效均低于40%；而BV2007的治疗效果达到51.54%。菌株组合Y5+X-3、Y5+BV2007、BV2007+X-2、X-1+ND-7、X-1+BV2007、X-1+X-2预防效果分别达到58.84%、53.36%、51.93%、49.94%、44.79%和42.30%，其余菌株组合的防效均低于40%；单一菌株BV2007、Y5、X-1、ND-7、X-2、X-3的防效均可达到63%以上。综合来看，组合生防菌的治疗效果和预防效果不高于单一菌株的防效（见表2）。

表2 11个菌株组合与6个单一菌株对离体枝条腐烂病的保护和治疗作用Table 2 Protective and therapeutic effects of eleven composite strains and six single strains on apple Valsa canker in vitro branches

续表：

2.4 田间试验测定生防菌株组合菌液对苹果树腐烂病的防治效果

选取离体枝条试验筛选出防效较好的8个组合生防菌X-1+X-2、X-1+BV2007、X-1+ND-7、Y5+X-3、Y5+BV2007、Y5+ND-7、BV2007+X-2和BV2007+ND-7进行田间试验，结果表明：BV2007+ND-7的保护防效最好，达到了58.56%，与阳性对照防效无显著差异；BV2007+ND-7和Y5+BV2007的田间治疗效果较好，分别是63.83%和51.83%，与阳性对照防效无显著差异P＞0.05（见表3）。

表3 组合生防菌对田间果树腐烂病的保护和治疗作用Table 3 The protective and therapeutic effects of combined biocontrol bacteria on apple Valsa canker in the field experiments

3 结论与讨论

国内外研究生防菌防治病害的报道越来越多，其中拮抗细菌在植物病害防治中凸显出优势并发挥重要作用［15-16］。拮抗细菌，特别是芽胞杆菌［7］，可分泌多种抗菌物质并促进植物生长，诱导植株产生抗病性［17］，在不良环境条件下形成抗逆、耐热的芽胞，使得微生物菌剂便于储存和运输［18］，这些特性使得芽胞杆菌成为生产上应用最为广泛的拮抗微生物。

传统的生物防治大多采用单一菌株防治单一病害，但生防菌使用中受不同生态条件、微生物区系以及生防菌自身不稳定等因素的影响，难以达到理想防效［19］。生防菌组合使用可在一定程度上解决单一菌株适应性差、环境依赖性强、防治效果偏低的问题。研究表明，利用生防细菌复合菌剂防治辣椒青枯病，与单一菌株相比, 菌株组合更能适应不同的土壤、多种病原物和环境变化，从而减轻病害的发生程度［20-21］。

关于生防菌株组合后提高对植物病害的防治效果已有大量研究。例如许艳丽等［22］发现木霉菌FMM35和FMM9组合后，对大豆根腐病有防治效果；Marjan等［23］将2株具有不同生防机制的假单胞菌组合，发现该组合对萝卜枯萎病有防治效果。但尚未见生防细菌组合后用于苹果树腐烂病的防治报道，本研究尝试将拮抗效果较好的菌株与促生效果较好的菌株进行组合用于防治苹果树腐烂病，离体枝条试验表明有较单一菌株防效提高的生防菌组合，但也有组合菌防效降低的现象，这与张雪艳等［24］的研究观点一致。陈志谊等［25］认为菌株组合在生产实践中，不一定会表现出增效，甚至可能会出现减效，只有在引入的位点群体增长后，才有可能表现出增效作用，这一说法与本研究发现基本吻合。后续将进一步优化菌株组合，改进配比浓度，从时间或者空间上进行菌株的组合，以便混合菌株能够定殖生长，为研发高防效、更适应田间应用的生防菌剂提供理论依据。