一株鸡源宋内志贺菌噬菌体的分离、生物学特性分析及预防试验研究

代永联 郝小静 衣服德 白光烨 檀学进 冯永胜

摘  要：从青岛地区某鸡场污水中分离出一株具有裂解特性的鸡源宋内志贺菌噬菌体，暂编号为PG2-01。经透射电镜观察，该噬菌体为肌尾噬菌体，头部直径约70 nm，呈立体对称二十面体。试验测定，该噬菌体裂变能力强，潜伏时间短，能在较长时间内维持较强的裂解能力，能够适应的酸碱度、温度范围较广。预防试验中，90%以上的雏鸡能得到有效预防，这对该噬菌体的研究有深远的实践意义及很高的应用价值。

关键词：宋内志贺菌;噬菌体;分离;裂解性;生物学特性

中图分类号：S858.31 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2021）02-0082-05

动物和人类都能感染志贺菌，感染后会出现腹泻等一系列症状，通常人们将志贺菌划分为4个群，A群痢疾志贺菌、B群福氏志贺菌、C群鲍氏志贺菌和D群宋内志贺菌[1]。宋内志贺菌是导致禽类细菌性痢疾的主要病原菌之一，目前主要使用抗菌药物防治禽类宋内志贺菌性痢疾，但由于细菌耐药性的产生，多数抗菌药物的防治效果差。大量使用抗生素，一方面会由于细菌耐药性增强、药物副作用大对畜禽健康造成危害，另一方面畜禽产品的药物残留会直接影响人类的食品安全。噬菌体广泛存在于自然环境中，具有较强的特异性，可在特定细菌内增殖，裂解细菌，达到杀灭和清除细菌的目的。噬菌体在耐药性细菌防治上具有很好的效果，无副作用，无药物残留，安全绿色，利于畜禽健康养殖。开展家禽宋内志贺菌性痢疾噬菌体的研究，对相关疾病的预防和治疗具有很大的应用价值。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和噬菌体来源

宋内志贺菌菌种从发病鸡分离纯化取得，由上海派森诺基因科技有限公司经16S rDNA 测序鉴定;噬菌体分离自青岛某鸡场污水。

1.1.2 试剂

SM悬浮液;营养琼脂（NA）半固体、固体、液体培养基;营养肉汤（NB）培养基;磷钨酸（pH 6.7，浓度2%）;氯化钠等试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体分离

取30 mL污水加入100 mL灭菌NB培养基，加入0.6 mL对数期宋内志贺菌菌液，36 ℃振荡培养16 h，取出静置60 min，12 000 r/min离心10 min，用0.22 um滤膜过滤上清液，取得噬菌体原液。取0.2 mL噬菌体原液与        0.2 mL对数期宋内志贺菌菌液均匀混合，室温静置15 min，使细菌表面均匀吸附噬菌体，与7 mL 56 ℃的NA半固体培养基均匀混合，迅速倒入NA固体培养基上制成双层平板，凝固后将平板倒置，36 ℃培养16 h，观察噬菌斑。

1.2.2 噬菌体纯化

挑取中间透亮、直径约2 mm的单个噬菌斑，移入1 mL营养肉汤培养基中，30 ℃水浴30 min，使噬菌体充分逸出，然后按“1.2.1 噬菌体分离”介绍的方法离心过滤，与0.2 mL对数期宋内志贺菌菌液等量混合均匀，移入  2 mL液体NA培养基中。依次纯化5次，获得高纯度的噬菌体。

1.2.3 噬菌体观察

在专用铜网上滴加效价为1×109 PFU/mL的噬菌体20 uL，室温放置20 min，用滤纸吸除多余的液体，1.5%磷钨酸负染15 min～ 20 min，吸除多余染色液并自然干燥，透射電镜下观察噬菌体形态。

1.2.4 噬菌体生物学特性观察及效价测定

用无菌生理盐水将0.2 mL纯化的噬菌体按10-1～10-9浓度梯度稀释，每个浓度分别取   0.2 mL，加入0.2 mL菌液混合均匀，按“1.2.1 噬菌体分离”介绍的方法铺NA双层板，每个浓度的噬菌体做3个平行，观察噬菌斑情况。取浓度适当、噬菌斑数量在30～300个之间的平板进行计数，以3个平行板的噬菌斑计平均数，计算噬菌体效价（PFU/mL=稀释倍数×平均板数×5）。

1.2.5 测定噬菌体最佳感染复数

取宋内志贺菌对数期菌悬液，按照0.001∶1、0.01∶1、0.1∶1、1∶1、10∶1、100∶1等比例加入噬菌体充分混合，静置15 min，36 ℃培养15 h，按“1.2.1 噬菌体分离”介绍的方法离心过滤，采用双层平板法，测定其最佳感染复数。

1.2.6 噬菌体一步式生长曲线测定

取对数期宋内志贺菌，根据感染复数加入噬菌体，36 ℃培养15 h，11 000 r/min离心1 min，弃上清，洗涤2次，36 ℃预热NB培养基，重悬沉淀，培养，测定其效价，参照杜崇涛[2]推荐的方法评价，绘制一步式生长曲线，计算发生裂解的具体规模。

1.2.7 噬菌体对温度和pH的敏感性测定

在50 mL NB中接种一个宋内氏志贺菌菌落，170 r/min培养12 h进入对数生长期，分别取0.5 mL至50 mL液体NA培养基中，于36 ℃、170 r/min培养15 h至对数生长前期，标记后各取0.3 mL置于96孔板中，用酶标仪测量OD600值，作为前期OD600值。

参照高苗等[3]介绍的方法对噬菌体溶液进行如下处理：（1）取7份1 mL噬菌体原液，分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃水浴锅加热30 min;（2）取7份1 mL噬菌体原液，加入pH范围在4～10的30 ℃液体NA培养基中，在36 ℃的水中温热8 min;每次取0.3 mL测量OD600值，此处的OD600值称为后期OD600值，前期OD600值和后期OD600值之间的差称为OD600差。上述测试重复3次，获得平均值。

1.2.8 噬菌体预防试验

将60羽15日龄雏鸡随机分为3组，每组20羽。第1组为空白对照组，接种生理盐水0.3 mL;第2组为感染对照组，接种0.3 mL效价为1.05×107 CFU/mL的宋内志贺菌;第3组为试验组，每羽鸡肌内注射0.3 mL效价为1.05×109 PFU/mL的噬菌体;24 h后各组用1.05×107 CFU/mL的宋内志贺菌攻毒，每羽鸡接种0.3 mL，记录各组雏鸡死亡情况。

2  结果

2.1 噬菌体的分离与纯化

噬菌体PG2-01是通过双层平板法将鸡场污水和宋内志贺菌共同培养，并选择中间透亮的最大噬菌斑，经反复纯化获得边缘光滑的圆形透明噬菌斑，其直径为1 mm～2 mm，详细情况参见图1和图2。

2.2 噬菌体的电镜观察

透射电镜观察发现，PG2-01噬菌体头部为二十面体立体对称结构，直径约为70 nm，有一可伸缩的尾鞘（图3）。按照国际病毒分类委员会的分类规则，PG2-01属于有尾噬菌体目。

2.3 噬菌体最佳感染复数测定

完成宋内志贺菌和噬菌体混合培养后采用双层平板法对其效价进行测定（表1），当感染复数为0.01时，其效价为2.85×109 PFU/mL，是6个配比中最高的，因此0.01是PG2-01感染宋内志贺菌的最佳感染复数。

2.4 绘制噬菌体PG2-01一步生长曲线

按照图4显示的生长曲线发现，在整个感染过程中，PG2-01的裂解量大约为186，潜伏时间约为20 min，暴发时长大约为40 min，随后进入稳定期。

2.5 噬菌体PG2-01敏感性测定

2.5.1 噬菌体PG2-01对温度的耐受力

温度范围处在30 ℃～60 ℃的菌液， OD600值的前后差值处于0以下，即加入经过纯化的噬菌体后，PG2-01将宋内志贺菌裂解并造成其死亡，间接表示噬菌体在温度为30 ℃～ 60 ℃的环境中活性最高，30 ℃～40 ℃的环境中菌液浓度最小，表明在30 ℃～40 ℃环境中的PG2-01噬菌体拥有最高的自身活性以及最强的裂解能力。当处理温度达到70 ℃后菌液OD600值在后期培养过程中明显升高，说明噬菌体在温度为70 ℃的环境中丧失自身活性（图5）。

2.5.2 噬菌体PG2-01对酸碱的耐受能力

pH为5～8时，菌液OD600差值都在0以下，这表示此时PG2-01的杀菌能力最强，当pH为4、9和10时，差值回到0以上，说明PG2-01的杀菌能力在该pH范围有所降低，pH低于4或高于9的环境不适合PG2-01杀菌和繁殖（图6）。

2.6 噬菌体PG2-01对宋内志贺菌感染的预防效果

由表2可知，感染之前预防性肌内注射噬菌体可有效预防雏鸡的感染，成活率比空白对照组的提高20%，对雏鸡的保护率可以达到90%，而感染对照组的成活率仅有30%，与空白对照组的相比降低了40%。

3  结论

PG2-01噬菌体能分解杀灭宋内志贺菌，具有生物特异性强、繁殖快、耐力好、环境适应性强、安全有效、成本低廉等优点，对鸡有很强的保护作用，发展前景非常广阔，具有很强的应用价值。

4  讨论

志贺菌会导致鸡发生以腹泻为主要症状的传染病。不同日龄、品种的鸡都可感染志贺菌，成年鸡的死亡率和发病率低于雏鸡的[4]。近年来，鸡志贺菌的多重耐药性呈明显增高的趋势，宋内志贺菌的感染比例也呈现增高趋势，因此研究无抗药性的志贺菌噬菌体势在必行。作者对该噬菌体的环境耐受能力进行了研究，结果显示其耐受能力较强，在较宽的pH及温度范围内都表现出极强的噬菌能力。预防性试验发现，噬菌体PG2-01对雏鸡具有较高的保护率，可以有效提高雏鸡的成活率。

参考文献

[1] 王建.我国宋内氏志贺菌流行特征、耐药性及变异研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2016.

[2] 杜崇涛，大肠杆菌O157噬菌体的分离鉴定及其初步应用[D].吉林：吉林大学，2008.

[3] 高苗，杨金广，刘旭，等.一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物學特性分析[J].中国农业科学院，2015（7）：1330-1338.

[4] 王硕，鸡源多重耐药志贺菌病的流行病学调查[D].吉林：吉林农业大学，2018.