响应曲面法优化联合提取结球红菊苣中菊苣酸和香豆素
2021-06-10王一婷朱建星刘佳欣贺梦瑶张万忠
王一婷，朱建星*，刘佳欣，贺梦瑶，张万忠
沈阳化工大学制药与生物工程学院（沈阳 110142）
结球红菊苣（Cichoricum intybusL. var.foliosumHegi.）是野生菊苣（Cichorium intybusL.）的变种，又名红菊苣、白菊苣等，为菊科菊苣属多年生草本植物[1-2]。菊苣中主要含有菊苣酸等多种活性物质，发现菊苣粗提物具有清肝利胆、降血脂、降血糖、抗肿瘤及免疫调节等多种药理活性[3]，菊苣中含有的菊苣酸、香豆素含量较为丰富且极性相近，但关于结球红菊苣中的菊苣酸、香豆素联合提取的研究报道比较少见[4]。作为一种高效绿色提取技术，复合酶解法提取效率高，不容易引入其他的杂质，而且不影响组织结构及目标物质的生物活性，成为当前研究热点[5]。以乙醇溶液为酶解反应溶剂，采用纤维素酶和果胶酶处理菊苣粉末的酶解工艺，对结球红菊苣中菊苣酸、香豆素进行联合提取，为结球红菊苣活性成分提取工艺的综合应用和菊苣的功能性食品开发及大规模生产提供理论依据[6-9]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
结球红菊苣（市场购买）；无水乙醇（分析纯，天津市博迪化工股份有限公司）；纤维素酶（＞15 000 U/g，国药集团化学试剂有限公司）；果胶酶（＞15 000 U/g，国药集团化学试剂有限公司）；菊苣酸对照品（纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司）；秦皮乙素对照品（纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司）。
ZWY-240恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；高效液相色谱（安捷伦1200）；全自动酶标仪（Synergy HTX美国伯腾仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 原料的预处理
取适量的结球菊苣，用吹风除尘后，干燥后磨粉过孔径0.425 mm筛，真空干燥后保存备用。
1.2.2 标准曲线的建立及结球菊苣菊苣酸、香豆素含量测定
菊苣酸标准曲线的建立：准确称取菊苣酸标准品配制质量浓度为2.00，3.33，5.00，6.25，8.33，10.00，12.50，16.67和25.00 μg/mL的标准溶液。以无水乙醇为空白对照，用酶标仪在326 nm波长下测定吸光度，以菊苣酸质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=0.045 6x-0.049 8（R2=0.999 7）。通过样品提取液测得的吸光度，在标准曲线范围内对应出相应菊苣酸含量，计算出对应的1 g红菊苣粉中的菊苣酸得率。菊苣酸提取得率的计算如式（1）。
式中：m为所测定溶液的菊苣酸质量，μg；V1为所取待测液体积；V为提取稀释液总体积；M为样品质量，g。
香豆素标准曲线的建立：准确称取秦皮乙素标准品配制质量浓度为1.76，5.28，10.56，14.08，17.6，21.12和26.4 μg/mL的标准溶液。以无水乙醇为空白对照，用酶标仪在345 nm波长下测定吸光度，以香豆素浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为Y=0.049 5x-0.011 8（R2=0.999 6）。通过样品提取液测得的吸光度，在标准曲线范围内对应出相应香豆素的含量，计算出对应的1 g红菊苣粉中的香豆素得率。香豆素提取得率的计算如式（2）。
式中：m为所测定溶液的香豆素质量，μg；V1为所取待测液体积；V为提取稀释液总体积，mL；M为样品质量，g。
1.2.3 酶解过程单因素试验
1.2.3.1 乙醇质量分数对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
称取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纤维素酶+果胶酶为2+0.4 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL），分别加入质量分数0，20%，40%，55%，60%，65%，70%和75%的乙醇。于55 ℃振荡，40 min。水浴85 ℃灭酶，将反应液抽滤。取滤液稀释100倍，用酶标仪测定菊苣酸、香豆素含量，计算提取得率。
1.2.3.2 加酶量（纤维素酶+果胶酶）对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
称取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纤维素酶+果胶酶分别为0，0.5+0.1，1+0.2，2+0.4和3+0.6 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL）加入质量分数65%乙醇，55℃振荡40 min。后续操作同1.2.3.1。
1.2.3.3 提取时间对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
称取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纤维素酶+果胶酶为2+0.4 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL）加入质量分数65%乙醇。于55 ℃振荡20，30，40，50和60 min。后续操作同1.2.3.1。
1.2.3.4 提取温度对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
称取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纤维素酶+果胶酶为2+0.4 mg的酶液，分别加入料液比1︰25（g/mL）的65%乙醇。分别在40，45，50，55和60 ℃，振荡40 min，后续操作同1.2.3.1。
1.2.4 响应面设计
为优化提取工艺设计，根据单因素试验对乙醇质量分数（A）、加酶量（纤维素酶+果胶酶）（B）、提取时间（C）、提取温度（D）确定最佳条件，设计四因素三水平响应面分析，分别用-1、0和1代表不同水平，以菊苣酸、香豆素提取得率作为响应值，采用Box-Behnken设计并建立数学模型。各试验因素与水平的设计如表1所示。
1.2.5 数据处理
试验中每个处理重复3次，采用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行回归分析。
表1 响应面因素设计水平表
2 结果与分析
2.1 提取菊苣酸、香豆素的单因素试验结果
2.1.1 乙醇质量分数对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
乙醇质量分数对菊苣酸、香豆素提取得率的影响见图1。与不加乙醇的水体系（乙醇质量分数0%）相比，在乙醇溶液体系中的纤维素酶和果胶酶有更大的酶促水解效率，酶对细胞壁的水解和乙醇溶液对菊苣总苷类物质的浸出产生协同效应[3]。使用水体系时，菊苣酸、香豆素提取得率均较低，而采用乙醇溶液水解体系可获得更高的提取得率。随着乙醇质量分数增大，菊苣酸、香豆素的提取得率也在增大，乙醇质量分数65%时，提取得率最大，乙醇质量分数大于65%时，提取得率下降，所以确定最优乙醇质量分数为65%，此条件下的提取得率比水体系中的提取得率高38%以上。
2.1.2 加酶量（纤维素酶+果胶酶）对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
加酶量对菊苣酸、香豆素提取得率的影响见图2。与不加酶相比，添加复合酶制剂明显提高菊苣酸和香豆素提取得率，分别提高36%和31.7%。提取得率随加酶量增大而逐渐增大，每克菊苣粉末加入2.0mg纤维素酶、0.4 mg果胶酶时，菊苣酸和香豆素的提取得率最大，但继续增加酶用量，反而导致提取得率出现下降的趋势，这可能是因为较多的酶黏附于菊苣细胞壁上，不利于菊苣酸、香豆素类化合物向溶剂中扩散。
图1 乙醇质量分数对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
图2 加酶量（纤维素酶+果胶酶）对菊苣酸、香豆素提取工艺的影响
2.1.3 提取时间对菊苣酸、香豆素提取得率的影响
提取时间对菊苣酸、香豆素提取得率的影响见图3。随着提取时间增长，菊苣酸、香豆素提取得率增大，40 min时提取得率达到最大，提取时间40 min后提取得率便下降，这是因为提取时间会直接影响有效成分的浸出，提取时间过短有效成分还没有充分反应，时间过长可能会导致有效成分降解，所以确定最优提取时间为40 min。
图3 提取时间对菊苣酸、香豆素提取工艺的影响
2.1.4 提取温度对菊苣酸、香豆素提取工艺的影响
提取温度对菊苣酸、香豆素提取工艺的影响见图4。随着提取温度增大提取得率不断升高，在50 ℃时达到最高，55 ℃以上提取得率有所下降，这是因为温度会增强细胞的透性，有利于内容物的有效浸出，但温度过高时会使菊苣酸、香豆素分解导致其提取得率下降，所以确定最优提取温度为50 ℃。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 Box-Behnken中心组合试验设计结果分析
采用Design-Expert 8.0.6软件（表2）进行回归拟合得到菊苣酸（Y1）、香豆素提取率（Y2）与提取因素乙醇质量分数（A）、酶量（B）、时间（C）、温度（D）之间的二次多元回归方程为Y1=3.41-0.018A+0.030B+0.063C+0.024D+0.008 5AB+0.17AC-0.042AD-0.028BC-0.14BD+0.097CD-0.65A2-0.40B2-0.36C2-0.11D2；Y2=2.38-0.001 917A+0.041B+0.049C+0.009 833D+0.019AB+0.12AC-0.016AD+0.016BC-0.12BD+0.066CD-0.62A2-0.30B2-0.26C2-0.11D2。
图4 提取温度对菊苣酸、香豆素提取工艺的影响
表2 响应曲面法试验设计及结果
由表3所示的方差分析数据可知，模型F=37.3，p＜0.000 1，表明模型对提取工艺达到极显著，CV=3.11%，R2adj=0.947 8，R2=0.973 9，证明模型拟合度良好，试验误差小，可以应用于响应曲面法优化提取结球菊苣菊苣酸。根据各因素的显著性检验p值的大小可以看出，各因素对菊苣酸提取工艺的影响大小为提取时间＞加酶量（纤维素酶+果胶酶）＞提取温度＞乙醇质量分数。
表3 菊苣酸提取率回归方程方差分析表
由表4所示的方差分析数据可知，模型F=52.88，p＜0.000 1，CV=3.45%，R2adj=0.962 9，R2=0.981 4，证明模型的拟合度良好，试验误差小，可应用于响应曲面法优化的提取结球菊苣香豆素。根据各因素的显著性检验p值的大小可以看出，各因素对香豆素提取工艺的影响大小为提取时间＞加酶量（纤维素酶+果胶酶）＞提取温度＞乙醇质量分数。
表4 香豆素提取率回归方程方差分析表
2.2.2 响应曲面图分析
响应曲面图可以更直观的反映各因素交互作用对响应值的影响。将A、B、C、D中任意2个因素与菊苣酸提取得率合为三维曲面图，分析比较图5的两两交互作用可知乙醇质量分数和时间、酶量和温度、时间和温度交互作用影响较大。
图5 各因素交互作用对菊苣酸得率影响的响应面图
图6 各因素交互作用对香豆素得率影响的响应面图
将A、B、C、D中任意2个因素与香豆素提取得率合为三维曲面图，分析比较图6的两两交互作用可知，乙醇质量分数和时间、酶量和温度、时间和温度交互作用影响较大。
2.2.3 验证试验
响应面设计优化提取工艺结球红菊苣各因素的最优值为乙醇质量分数65.04%，每克菊苣粉末加酶量（纤维素酶+果胶酶）2.04+0.408 mg、提取时间42.06min、提取温度55.91 ℃。为方便试验操作将条件修正为乙醇质量分数65%，加酶量（纤维素酶+果胶酶）2+0.4 mg，时间42 min，温度56 ℃。在此条件下进行3次重复验证试验，菊苣酸提取得率为3.471%，3.467%和3.472%，平均提取得率为3.47%，香豆素提取得率为2.437%，2.441%和2.445%，平均提取得率为2.44%，与理论值基本吻合。
3 结论
试验以结球红菊苣为原料采用复合酶（纤维素酶+果胶酶）联合水解提取菊苣酸、香豆素，并通过设计响应曲面法进行试验分析及优化，确定最优提取工艺条件为乙醇质量分数65%、每克菊苣粉末加酶量（纤维素酶+果胶酶）2 mg+0.4 mg、提取时间42 min、提取温度56 ℃，菊苣酸提取得率为3.47%，香豆素提取得率为2.44%，与模型预测的提取得率相差误差较小，模型与实际结果相吻合。因此，利用设计响应曲面法优化对结球菊苣菊苣酸、香豆素提取的联合提取工艺是科学可行的，与不加酶的提取工艺相比，采用乙醇溶液体系添加复合酶制剂的提取工艺明显提高菊苣酸和香豆素的提取得率，分别提高36%和31.7%，且更快速和环保。
