α-淀粉酶和糖化酶协同酶解葛根淀粉的工艺

陈晓镝，廖明晰，彭凌*

西南科技大学生命科学与工程学院（绵阳 621010）

葛根又叫葛藤、甘葛、鸡齐根等，属豆科植物。其味甘，性凉，是中国药食两用的植物[1]。新鲜葛根含淀粉20%以上、蛋白质2.1%、异黄酮类物质2%，以葛根素为主[2]；还有一些人体必需氨基酸和微量元素等。葛根中的葛根素对高血糖、高血压、高血脂及心脑血管疾病有一定疗效，另外还有防治骨质疏松、抗氧化、抑制病原菌繁殖、保护心肌、保护神经细胞、预防更年期综合征等功效[3]。试验对库存葛根淀粉综合应用，以单因素与正交因素为基础，探讨其酶解工艺对其影响，为实际生产提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验原料

葛根淀粉（绵阳市山葛农业科技有限公司）；液化酶（即α-淀粉酶，酶活力20 000 U/g，浙江一诺生物科技有限公司）；糖化酶（即β-淀粉酶，酶活力50 000 U/g，南京纳满生物科技有限公司）。

1.2 试验试剂

碳酸氢钠、盐酸、碘化钾、无水硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠（四水）、氢氧化钠、乙酸锌、冰乙酸、亚铁氰化钾、碘（粒状）、碘化钾、葡萄糖（均为分析纯）；柠檬酸（一水）、异抗坏血酸（均为食品级）。

1.3 仪器与设备

HH-8数显恒温水浴锅（常州市金坛华特实验仪器有限公司）；PHS-3C酸度计（成都世纪方舟科技有限公司）；UV752紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；BSA223S电子天平（0.001 g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；LDZ5-2低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；DHG-9145A电热恒温干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；DL-1电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；C21-FK2101多功能电磁炉（广东美的生活电器制造有限公司）。

1.4 分析方法

1.4.1 糊化度的测定方法

采用碘呈色分析法快速测定糊化度。取出糊化液后立即于离心机中以5 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，加去离子水20 mL，加入0.05 mol/L的碘-碘化钾溶液1 mL，加水定容至50 mL，以碘-碘化钾溶液为空白，用分光光度计在575 nm波长下测定吸光度，即为其碘呈色度，用碘呈色度即可快速反映糊化度[4]。试验重复1次，作为重复组。

1.4.2 还原糖的测定方法[5]

采用GB 5009.7—2016的直接滴定法测定还原糖。重复试验3次。

1.4.2.1 标定碱性酒石酸铜溶液

分别吸取甲液与乙液5.0 mL于锥形瓶，加水10 mL，并加入几颗玻璃珠，加热至沸，以葡萄糖标准液趁热迅速滴定，直至蓝色刚好消失为滴定终点，平均3次取平均消耗的葡萄糖量，记为m，即每10 mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖质量（mg）。

1.4.2.2 测定还原糖

吸取淀粉液化液上清液V1mL于250 mL容量瓶，缓慢加入乙酸锌溶液与亚铁氰化钾溶液各5 mL，加水定容并混匀，静置30 min后过滤，为待测样液。以锥形瓶为反应容器，吸取酒石酸铜甲液与乙液各5.0mL，水10 mL，加入玻璃珠，加热至沸，以待测样液趁热迅速滴定直到蓝色刚好消失，重复3次后记录平均消耗量V（mL）。

1.4.2.3 计算公式

测得的还原糖质量浓度按式（1）计算。

式中：X为液化液中还原糖质量浓度，g/L或mg/mL；m为碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖质量，mg；V1为吸取稀释的液化液体积，mL；F为系数，试验取0.8；V为测定时平均消耗的待测液体积，mL；250为定容体积，mL；1 000为换算系数。

1.5 试验设计

1.5.1 糊化试验

葛根淀粉糊化时，在固液比1：8，1：12，1：16，1：20，1：24和1：28 g/mL，温度65，70，75，80，85和90 ℃，时间0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0，pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5下水浴加热。

1.5.2 液化试验

在α-淀粉酶用量0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%，pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，时间0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h，温度50，55，60，65，70和75 ℃下水浴加热。

1.5.3 糖化试验

在β-淀粉酶用量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%和1.5%，pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0，时间0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h，温度45，50，55，60，65和70 ℃下水浴加热。

1.6 工艺优化试验

在单因素试验基础上，筛选出最佳水平进行正交试验，得出优化工艺条件。

1.6.1 糊化工艺优化

1.6.1.1 固液比

基于70 ℃、pH 8.0下水浴加热1.5 h，通过设置固液比1：8，1：12，1：16，1：20，1：24和1：28 g/mL[6]，测定糊化度及观察组织状态，从而选取最佳3个水平。

1.6.1.2 pH

基于固液比1：16 g/mL、70 ℃下水浴加热1.5 h，通过设置pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5，测定相应糊化度并观察组织状态，从而比较选取最佳3个水平。

1.6.1.3 加热时间

基于固液比1：16 g/mL、70 ℃、pH 8.0下水浴加热，通过设置水浴加热时间0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h，测定相应糊化度并观察其组织状态，比较并选取其中最优3个水平。

1.6.1.4 加热温度

基于固液比1：16 g/mL、pH 8.0下水浴加热1.5 h，通过设置水浴加热温度65，70，75，80，85和90℃，测定相应糊化度并观察其组织状态，比较并选取其中最佳3个水平。

1.6.1.5 正交试验

以上述4个单因素试验得出其3个最优水平，通过L9(34)试验设计，以糊化度及组织状态为指标，确定最佳糊化条件。4个因素分别为温度（A）、固液比（B）、pH（C）、时间（D）。

表1 葛根淀粉糊化L9(34)正交试验因素水平表

1.6.2 液化工艺优化

经预糊化后，通过测定不同淀粉酶用量、酶解温度、酶解时间、pH下的还原糖质量浓度，优选3个最佳水平，进行正交试验得出最佳液化工艺条件。

1.6.2.1α-淀粉酶用量

基于pH 7.5、60 ℃下水浴加热1 h，设置酶用量梯度0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%[8]，通过测定还原糖质量浓度选取最佳3个水平。

1.6.2.2 pH

基于酶用量0.15%、60 ℃下水浴加热1 h，设置pH 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5和8.0[9]，通过测定还原糖质量浓度选取最佳3个水平。

1.6.2.3 酶解时间

基于酶用量0.15%、pH 7.5、60 ℃下水浴加热，设置加热时间0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h[10]，以还原糖质量浓度为指标，测定并选取最佳3个水平。

1.6.2.4 酶解温度

基于酶用量0.15%、pH 7.5下水浴加热1 h，设置温度50，55，60，65，70和75 ℃，以还原糖质量浓度为指标，测定并选取最佳3个水平。

1.6.2.5 正交试验

通过L9(34)试验设计，以还原糖质量浓度为指标，确定其最佳液化条件。选取4个因素分别是酶用量（A）、pH（B）、酶解时间（C）、酶解温度（D），结合最佳液化的3个水平，制定得其四因素三水平表，如表2所示。

表2 葛根淀粉液化L9(34)正交试验因素水平表

1.6.3 糖化工艺优化葛根淀粉经糊化、液化之后，通过分析在不同糖化酶用量、酶解温度、酶解时间、pH下的还原糖质量浓度，确定正交优化试验，得出最佳糖化工艺条件。

1.6.3.1β-淀粉酶用量

基于pH 5.0、55 ℃下水浴加热1 h，设置酶用量0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.2%和1.5%[12]，通过测定还原糖质量浓度选取最佳3个水平。

1.6.3.2 pH

基于酶用量1.2%、55 ℃下水浴加热1 h，设置pH3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0[13]，通过测定还原糖质量浓度选取最佳3个水平。

1.6.3.3 酶解时间

基于酶用量1.2%、pH 5.0、55 ℃下水浴加热，设置加热时间梯度为0.25，0.50，1.00，1.50，2.00和2.50 h[14]，以还原糖质量浓度为指标，测定并选取最佳3个水平。

1.6.3.4 酶解温度

基于酶用量1.2%、pH 5.0下水浴加热1 h，设置温度梯度为45，50，55，60，65和70 ℃，以还原糖质量浓度为指标，测定并选取最佳3个水平。

1.6.3.5 正交试验

通过L9(34)试验设计，以还原糖质量浓度为指标，确定其最佳糖化条件。选取4个因素分别是酶解温度（A）、糖化酶用量（B）、pH（C）、酶解时间（D），制得四因素三水平表如表3所示。

表3 葛根淀粉糖化L9(34)正交试验因素水平表

1.7 试验数据处理

通过软件Origin 7.5处理单因素试验数据，并作曲线图；通过软件SPSS 17.0进行正交试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 葛根淀粉糊化工艺优化结果

2.1.1 糊化工艺优化条件分析

从图1a可见，随着pH上升，糊化度逐渐升高，在pH 7.0左右变化较为平缓，pH 8.0以后逐渐稳定。所以选取最佳的3个水平为pH 7.5，8.0和8.5。

从图1b可见，温度对糊化的影响很大。70 ℃开始，糊化度迅速升高，85 ℃后逐渐平缓，所以选取最佳的3个水平为80，85和90 ℃。

从图1c可见，糊化时间越长，糊化度越高，糊化时间2.5 h后趋于极限。所以选取最佳的3个水平为2.0，2.5和3.0 h。

从图1d可见，固液比1：20 g/mL时最高。固液比1：8到1：20 g/mL之间时，加水越多糊化度越高；固液比超过1：20 g/mL后，糊化度较缓慢地降低。所以选取最佳的3个水平为1：16，1：20和1：24 g/mL。

图1 糊化工艺优化单因素试验结果

2.1.2 糊化工艺优化正交试验结果

基于4个单因素试验选出较优的3个水平做出的正交优化试验结果如表4所示。

比较表4中各因素所对应的极值可知，影响葛根淀粉糊化度的主次顺序为温度（A）＞时间（D）＞固液比（B）＞pH（C）。正交试验优选的最优组合为A3B2C1D3，即在90 ℃，固液比1：20 g/mL，pH 7.5下水浴加热3 h，可得最高糊化度，按最优条件糊化后2次测定其糊化度为27.56%和27.98%。

表4 糊化工艺优化正交试验设计及结果

2.2 葛根淀粉液化工艺优化结果

2.2.1 液化工艺优化条件分析

由图2a可知，酶用量越多还原糖质量浓度越高，到0.25%趋于极限。故可以确定最佳3个水平为0.20%，0.25%和0.30%。

由图2b可知，pH＜7.0时还原糖质量浓度随pH升高而升高，pH＞7.0时，随pH升高而有所降低。在酸性环境下的液化效果不好，在pH 7左右比较合适。故选择3个水平为6.5，7.0和7.5。

由图2c可知，酶解1 h以内，酶解时间越长，还原糖质量浓度越高。酶解1 h后还原糖质量浓度基本趋平，故可以确定较优3个水平为1.0，1.5和2.0 h。

由图2d得出，温度小于60 ℃时，随着温度升高，还原糖质量浓度升高；温度超过60 ℃后，还原糖质量浓度趋于平缓。故可确定较优3个水平为55，60和65 ℃。

图2 液化工艺优化单因素试验结果

2.2.2 液化工艺优化正交试验结果

基于4个单因素试验所选出较优的3个水平做出的正交优化试验结果如表5所示。

表5 液化工艺优化正交试验设计及结果

由表5所示的各因素所对应的极值可以看出，主次因素依次为时间（C）＞酶用量（A）＞温度（D）＞pH（B），液化工艺最佳因素水平为A3B1C3D3，即在α-淀粉酶用量0.30%，pH 6.5，65 ℃下水浴加热酶解2 h，其还原糖质量浓度最高，按最优条件液化后2次测定其还原糖质量浓度为18.81和18.25 g/L。

2.3 葛根淀粉糖化工艺优化结果

2.3.1 糖化工艺优化条件分析

由图3a可以看出，还原糖质量浓度与酶用量成正比，且影响很大。酶用量1.0%之后逐渐趋平，故可以确定3个较优水平为1.0%，1.2%和1.5%。

由图3b看出，pH 5.0时还原糖质量浓度达到最高，往两侧逐渐减小。故可以选择出其最优3个水平的pH为4.5，5.0和5.5。

从图3c可以看出，酶解时间越长，还原糖质量浓度越高，酶解时间1.5 h后逐渐趋于平缓。故可以筛选出较优3个水平为1.0，1.5和2.0 h。

由图3d可以看出，酶解温度越高，还原糖质量浓度越高，温度超过60 ℃之后逐渐趋于平稳。所以可以选出较优3个水平为60，65和70 ℃。

图3 糖化工艺优化单因素试验结果

2.3.2 糖化工艺优化正交试验结果

基于4个单因素试验所选出较优的3个水平，做出正交优化试验结果表6所示。

表6 糖化工艺优化正交试验设计及结果

由表6所示的极差分析可以看出，主次因素依次为pH（C）＞时间（D）＞酶用量（B）＞温度（A）。糖化工艺最佳因素水平为A2B2C1D2，即在65℃，β-淀粉酶用量1.20%，pH 4.5下水浴加热酶解1.5 h，其还原糖质量浓度最高，按最优条件糖化后2次测定其还原糖质量浓度为68.94和69.78 g/L。

3 结论

1) 最佳糊化工艺条件为固液比1：20 g/mL，pH 7.5，水浴加热糊化温度90 ℃，糊化时间3 h，可得到最佳葛根淀粉糊化液。

2) 最佳液化工艺条件为α-淀粉酶添加0.30%（以淀粉干基计），pH 6.5，水浴加热酶解温度65 ℃，酶解时间2 h，可得到最佳淀粉液化液。

3) 最佳糖化工艺条件为β-淀粉酶添加1.2%（以淀粉干基计），pH 4.5，水浴加热酶解温度65 ℃，酶解时间1.5 h，可得到最佳淀粉糖化液。